On the mechanism of action of 1-nitroso-3-nitro-1-methylguanidine during induced mutation. II. Products of the reaction of 1-nitroso-3-nitro-1-methylguanidine with nucleic bases, nucleosides, nucleosidephosphatesmand homopolyribonucleic acids

Full text of DOI:10.1515/znb-1968-1202

Die Flächenverhältnisse der identifizierten Banden
rohres ab. In Tab. 6 b sind die in den höhersiedenden
in den hochsiedenden Anteilen sind in Tab. 5 b zusam- Anteilen nachgewiesenen Produkte zusammengestellt.
mengestellt.
Bei der Umsetzung der Diphenylalkane befand sich
kurz vor dem Entladungsrohr ein mit Heißluft beheiz-
ter Kolben mit der Substanz. Die Zusammensetzung
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem
Fonds der Chemischen Industrie danke ich für die
der entstandenen Destillate ist in Tab. 6 a wiedergege- finanzielle Unterstützung der Arbeit, Herrn Dr. W.
ben.
K ö n ig für die Aufnahme der Massenspektren, Herrn
Dr. K . S c h e ffle r für die Überlassung einer Mikrowel-
Höhersiedende Produkte schieden sich zusammen mit
nichtumgesetztem Material am Ende des Entladungs- lenapparatur.
Zum Wirkungsmechanismus von l-Nitroso-3-nitro-1-methyl-guanidin
bei der Mutationsauslösung
II. Produkte der Reaktion von l-Nitroso-3-nitro-1-methyl-guanidin
mit Nucleobasen, Nucleosiden, Nucleosidphosphaten und Homopolyribo-
nucleinsäuren
F.
L
i n g e n s , J. Rau und R. s ü s s m u t h
Institut für Mikrobiologie und Molekularbiologie der Universität Hohenheim (Stuttgart-Hohenheim)
(Z. Naturforschg. 23 b, 1565— 1570 [1968]; eingegangen am 26. Juli 1968)
l-Nitroso-3-nitro-l-methyl-guanidine (NNMG) (at pH 5,5 resp. 6,0) methylates and deaminates
the bases of nucleic acids. We treated nucleic bases, nucleosides, nucleoside phosphates and homo-
polyribonucleic acids with NNMG and we found the following methyl derivates of adenine:
1-methyladenine, 3-methyladenine and A8-methyladenine: of guanine: 7-methylguanine and of
cytosine: 1-methylcytosine and 3-methylcytosine. Moreover bases of the nucleic acids were deami-
nated: adenine to hypoxanthine and guanine to xanthine.
Material und Methoden
In der ersten Mitteilung1 haben wir über die
Wirkung von l-Nitroso-3-nitro-l-methyl-guanidin
(NNMG) auf die Matrizenaktivität der Polynucleo-
tide bei der zellfreien Proteinsynthese berichtet.
Citronensäure-Phosphat-Puffer nach M c l l v a i n e :
Gemisch von 0,2-m. Na2HP04 und 0,1-m. Citronen-
säure.
Zur Dünnsdiichtchromatographie verwendete Lauf-
mittel:
Für die Mutationsauslösung durch NNM G2-8
kommen vor allem 3 Reaktionen mit den Nucleo-
basen in Frage: die Methylierung1,9’ 10, die Des-
aminierung x' 11 und die Nitroguanylierung. Wir
haben Methylierung und Desaminierung hauptsäch-
lich unter ähnlichen Bedingungen (bei 37° oder
Zimmertemperatur und pH 5,5 bzw. 6,0) unter-
sucht, wie sie bei der Mutationsauslösung vorliegen.
Sl: n-Butanol/Eisessig/Wasser (4/1/1), S2: Metha-
nol/konz. Salzsäure/Wasser (7/2/1), S3: 3% NH4C1/
H20, S4: Isopropanol/Wasser/Ammoniak (8/l/l), S5:
n-Butanol/Wasser (l/ ll), S6: Isopropanol/konz. Salz-
säure/Wasser (65/16/19), S7: Isopropanol/Wasser
(6/4), S8: n-Buthanol/Äthanol/Wasser (5/2/3), S9:
n-Butanol (wassergesättigt)/Ammoniak (100/1), S10:
Äthanol/Wasser/Ammoniak (80/8/2).
1 P. C h a n d r a , A. W a C k e r , R. S ü SSm uth u. F. L in g e n S, Z. Na-
turforschg. 22b, 512 [1967].
6
F . L in g e n s u . O . O ltm a n n s, Z . Naturforschg. 21b, 660
[1966].
2 J. D. M a n d e ll u . J. G r e e n b e r g , Biochem. biophysic. Res.
Commun. 3, 575 [I960].
7 D. r . m CC a L L a , Science [Washington] 148, 497 [1965].
8 H. B. S in g er u. H. F r a e n k e L -C o n r a t , Proc. nat. Akad. S e i.
3 J. D. M a n d e ll, P. L . W o o d y u . J. G r e e n b e r g , J. Bacteriol.
81, 149 [1961].
4 A. J.
[1964].
5 R. S C h W a ie r , Z. Vererbungslehre 97, 55 [1965].
U S A 58, 234 [1967].
9 J. R a u u . F . L in g e n s, Naturwissenschaften 54, 517 [1967].
10 F . L in g e n s, R . S ü ssm u th , A. W a c k e r u . P. C h a n d r a , Natur-
wissenschaften 54, 492 [1967].
11 F . K. Zim m erm ann, R . S c h w a ie r u. U. v . L a e r , Z . Vererbungs-
lehre 97, 68 [1965].
M ü l l e r u . T. G ic h n e r , Nature [London] 201, 1149
Unauthenticated
Download Date | 9/26/19 5:23 AM

U m s e t z u n g e n von N N M G mit Nu c l e o -
basen und i hr e n D e r i v a t e n
1,5*14 cm), Fraktionen ca. 10 ml; wäßrige Lösung
wurde aufgezogen und mit steilem Gradienten (70 ml)
auf 60-proz. Methanol gebracht. Ab Fr. 71 wurde mit
50 ml HaO äquilibriert und die Elution mit 0,2-m.
NH4HC03fortgesetzt. Fr. 99 —106 Inosin.
Adenin: 20,7 mg (0,15 mMol) Adenin wurden in
4.4 ml Puffergemisch vom pH 5,5 bei 80 °C gelöst und
dazu 218 mg (1,5 mMol) NNMG gegeben. Nach
34 Stdn. ist das Reaktionsgemisch an Dowex 1X8 (100
bis 200 mesh, Cle/H20, 1,5-20 cm) getrennt worden:
je 150 Tropfen (10 ml) NH3-Lösung von pH 10, wo-
durch Adenin zurückgehalten wird. Fraktionen 1—20
wurden an Dowex 50 WX12 (200 —400 mesh, H®/H20,
27-7 cm) wiederholt getrennt. Je 150 Tr. H20 Fr. 101
bis 120 (die Guanidine laufen durch. Nucleobasen wer-
den zurückgehalten), 2-n. HCl Fr. 121 ff.
Dünnschichtchromatographie an MN 400
Substanz
Fr. 99-106
Inosin
7?/-Wert in Si
0,08
0,09
S6
0,28
0,25
80 mg (0,03 mMol) Adenosin wurden in 10 ml Puf-
ferlösung pH 5,5 mit 40 mg (0,27 mMol) NNMG bei
37° gehalten. Nach 5 Tagen Trennung an Dowex 1X8
(100-200 mesh, C10/H2O, 1,5-11,3 cm) mit NH3-
Lösung von pH 10. Fraktionen zu 10 ml. Fraktionen 9
bis 46, Rechromatographie an Dowex 50 WX12 (200
bis 400 mesh, H®/2-n. HCl, 2-7 cm), Fraktionen zu
10 ml:
Dünnschichtchromatographie an MN 400
Substanz
/?/-Wert in
Si
S2
Fr. 125 ff.
Hypoxanthin
0,26
0,15
0,27
0,20
Fr.150 —168 3-Methyladenin [Amax = 273nm (155)].
Fr. 180 —240 Adenin und oder 1-Methyladenin
[2 max = 261 nm (200)].
Fr. 6—8
Nitroguanidin (Amax 264nm),
Fr. 9—11 Hypoxanthin (A max 248 nm),
Fr. 60 —140 1-Methyladenin (A max 260 nm).
20 mg (0,15 mMol) Adenin und 220 mg (1,5 mMol)
NNMG wurden in 8 ml Pufferlösung von pH 5,5 bei
Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach 6 Tagen Auf-
trennung von 4 ml an Dowex (wie oben), je 150 Tr.
H20. Nach wiederholter Trennung an Dowex 50 (wie
oben), je 150 Tr. H20 Fr. 101 —120, 2-n. HCl Fr.
121 - 130, 3-re. HCl Fr. 131 - 180.
Adenosinmonophosphat: 10 mg (0,03 mMol) Adeno-
sinmonophosphat wurden bei 37° in 4 ml Puffergemisch
vom pH 5,5 mit 50 mg (0,34 mMol) NNMG umgesetzt.
Nach Vortrennung an Dowex 1X8 (100 —200 mesh,
OH0/H2O, 1,5-20 cm) Trennung an Dowex 50WX12
(200 —400 mesh, H®/H20, 2-7 cm), Fraktionen zu
10 ml: Fr. 16—19 Desaminierungsprodukt (A max =
246 —252 nm).
Fr. 137 —143 3-Methyladenin [A max = 273 nm
(140)].
Guanin: 20,6 mg (0,14 mMol) Guanin wurden mit
202 mg (1,37 mMol) NNMG in 4 ml Pufferlösung vom
pH 5,5 drei Stdn. lang auf 80 °C erhitzt.
Fr. 145 —170 1-Methyladenin + Adenin [2 max =
261 nm (150)].
Adenosin: 20,0 mg (0,07 mMol) Adenosin wurden
in 5,5 ml Puffergemisch von pH 5,5 gelöst, mit 110 mg
(0,75 mMol) NNMG versetzt und bei Zimmertempera-
tur stehengelassen. Die fast farblose Reaktionslösung
wurde mit Methanol versetzt, bis sie davon ungefähr
60% enthielt, und der Trennung unterworfen an Dowex
1X8 (100 —200 mesh), OHG/60-proz. Methanol, 1,5-20
cm).
Dünnschichtchromatographie
Substanz
Lösung
7?/-Wert an MN 400/SI S4 DEAE/S5
0,20
0,20
0,30
0,30
0,02
0,02
Xanthin
UV-Spektrum von Rf 0,30 (MN 400/S4) : Amax =
267 nm (H20), Amax = 261nm (n/l0HCl).
Guanosin: 50 mg (0,18 mMol) wurden in 10 ml Puf-
ferlösung von pH 5,5 mit 260 mg (1,77 mMol) NNMG
4 Tage auf 37° gehalten.
Fr. 26 —46 1-Methyladenosin: Amax = 259 nm (H20),
Amax = 257 nm (n/l0HCl).
Dünnschichtchromatographie
Dünnschichtchromatographie an MN 400
Substanz
i?/-Wert an MN 400/S4 DEAE/S5
Substanz
i?/-Wert in S4
S7
Fr. 26-46
Adenosin
0,60
0,33
0,70
0,38
Nitroguanidin
0,65
0,80
0,30
0,76
0,85
0,60
1-Methyl-3-nitroguanidin
Guanosin
Massenspektrum von Fr. 26 —47: m/e = 168 (3,5%),
167 (34%), 150 (8%), 149 (100%), 113 (13%),
112 (11%), 104 (8%), 84 (5%), 83 (11%), 71
(27%), 70 (33%), 69 (9%).
Substanz mit heller Fuoreszenz
im UV-Licht (254 nm)
0,13
0,40
100,5 mg (0,36 mMol) Adenosin wurden mit 549,7
mg (3,7 mMol) NNMG in 11 ml Pufferlösung von pH
5.5 bei Zimmertemperatur und Lichtabschluß gehalten.
Nach spätestens 14 Tagen war alles NNMG verbraucht.
Trennung an Dowex 1X8 (100 —200 mesh, 0He/H20,
Säulenchromatographie der hydrolysierten Probe an
Dowex 50WX12 (200-400 mesh, H® 12-n. HCl, 2-7
cm) Fraktionen zu 10ml: Fr. 4—10 enthalten Nitro-
guanidin und l-Nitro-3-methyl-guanidin, 23 —40 Gua-
nin, 46—62 7-Methyl-guanin.
Unauthenticated
Download Date | 9/26/19 5:23 AM

Substanz
ify-Werte und Aktivität in IpM
SI
S3
S8
S9
Adenin
0,50
0,26
0,50
0,48
1-Methyladenin
3-Methyladenin
N 6-Methyladenin
0,15
3112
0,68
308
0,32
236
0,27
51,9 ± 1,1
0,40
198
0,36
356
0,61
36,6 ± 1,1
0,15
347
0,68
164
0,35
21,9 ± 1,1
6,0 ±0 ,9 *
0,70
101
0,73
13,9 ± 1,0
l-Nitro-3-methyl-
guanidin
0,64
36263
0,63
52470
0,81
2136
0,66
2650
Tab. 1. Methylierungsprodukte nach Behandlung von Adenin mit 14C-Methyl-NNMG bei pH 6 und 37° in Citronensäure-Phos-
phat-Puffer.
Substanz
Ü/-Werte und Aktivität in IpM
S3
S9
SI
S8
Adenin
0,45
0,48
0,45
0,26
0,34
10,1 ± 0,9
1-Methyladenin
3-Methyladenin
N6-Methyladenin
0,14
72
0,62
10,9 ± 0,9
0,21
15,5 ± 1,0
0,62
10,9 ± 0,9
0,15
10,6 ± 0,9
0,38
4,0 ± 0,8 *
0,35
11,5 ± 1,3
0,34
0,70
0,68
0,63
8,8 ± 0,9
7,9 ± 1,2
3,6 ± 0,7
3,9 ± 0,6
Tab. 2. Methylierungsprodukte nach Behandlung von Poly-A (Bedingungen wie Tab. 1). * Durch Rechromatographie erhaltene
Werte.
10
mg (0,035 mMol) Guanosin und 52 mg (0,35
E i n w i r k u n g von 14C -M e t h y l - N N M G auf
N u c l e o b a s e n bzw. N u c l e i n s ä u r e n
mMol) NNMG wurden in 10 ml Pufferlösung von pH
5,5 5 Tage bei 37° gehalten. Die Trennung des Reak-
tionsgemischs erfolgte an Dowex 50 (wie oben), Frak-
tionen zu 10ml, H20 1—20, 2-n. HCl 21 ff.: Fr. 2—13
Nitroguanidin und l-Nitro-3-methylguanidin, 23—33
Guanosin und Xanthin, 35 —55 Guanin.
Darstellung von UC-Methyl-NNMG (in Anlehnung
an die Vorschrift von McKay 12) : 2 mc 14C-Methylamin-
hydrochlorid (spez. Aktivität ca. 30 mc/mMol) gelöst
in Äthanol, wurden unter Eiskühlung mit einigen Trop-
fen konz. NNMG-Lösung versetzt. 40 mg (1,3 mMol)
Methylamin wurden als 40-proz. methanolische Lösung
zugetropft und dazu soviel festes NNMG zugegeben,
daß sich insgesamt 250 mg (1,7 mMol) davon im Reak-
tionsgefäß befanden. Nach Beendigung der Gasentwick-
lung sind die Kristalle von l-Nitro-3-methyl-guanidin
abfiltriert worden. Die Substanz wurde in einem klei-
20
mg (0,07 mMol) Guanosin in 5,2 ml Pufferlösung
von pH 5,5 wurden bei Zimmertemperatur der wäßri-
gen Lösung von 104 mg (0,70 mMol) NNMG ausge-
setzt.
Dünnschichtchromatographie
Substanz
7?/-Wert an MN 400/SI
S4
DEAE/S5
nen E r 1e nm ey e r -Kolben in 0,18 ml HNOs (d
=
Reaktionslösung
Xanthosin
0,03
0,03
0,17
0,17
0,01
0,01
1,42) aufgelöst. Die Lösung ist dann mit 0,8 ml H20
verdünnt worden. Unter ständigem Rühren wurden
80 mg (1,16 mMol) NaN02, gelöst in 0,12 ml H20,
in 5 Min. zugegeben. Nach 20 Min. langem Rühren
sind die gelben Kristalle des 14C-Methyl-NNMG abfil-
triert worden (spez. Aktivität 2 mc/mMol).
Umsetzung der Nucleobasen bzw. der Nucleinsäuren
mit UC-Methyl-NNMG: Als Reaktionslösung diente
Phosphat-Citrat-Puffer von pH 6. 1mg Base (Adenin
oder Cytosin) bzw. 1mg Nucleinsäure (Poly-A, Poly-C,
Poly-UG) und 0,3 —1,0 mg 14C-Methyl-NNMG in 1ml
Guanosinmonophosphat: 8 mg (0,022 mMol) Guano-
sinmonophosphat wurden in 10 ml Puffergemisch vom
pH 5,5 mit 40 mg (0,27 mMol) NNMG umgesetzt und
5 Tage a) bei Zimmertemperatur, b) bei 37 °C gehal-
ten. Auftrag der Reaktionsprodukte an einer Säule von
Dowex 50WX12 (200-400 mesh, H®/2-n. HCl, 2-7
cm) und Prüfung bei 260 nm: a) Fr. 48 —58 flacher
und b) Fr. 44 —59 deutlicher Absorptionspeak von
7-Methylguanin.
Unauthenticated
Download Date | 9/26/19 5:23 AM

Pufferlösung wurden 24 —48 Stdn. bei 37 °C geschüt-
telt. Die Nucleinsäuren wurden ungefähr 10 Stdn. lang
durch Dialyse gegen deion. Wasser gereinigt. Darauf
wurden Poly-A und Polv-UG mit 1-ra. HCl bei 100°
2 Stdn., Poly-C mit 20-proz. HCl im zugeschmolzenen
Rohr bei 120° 2 Stdn. hydrolysiert.
Derivate des Adenins
Wird Adenin bei pH 5,5 bei Zimmertemperatur
und bei 80° mit NNMG bis zur Entfärbung des
Mutagens umgesetzt, so lassen sich nach säulenchro-
matographischer Trennung 1-Methyladenin und
3-Methyladenin isolieren. Der Nachweis erfolgte durch
die UV-Maxima bei 261 nm bzw. 273 nm und durch
Dünnschichtchromatographie in 2 Systemen. Nach
einer Umsetzung des Adenosins bei Zimmertempe-
ratur und 37° mit NNMG wurde nach Auftrennung
nach dem Verfahren von D e c k e r 13 1-Methyladeno-
sin durch das UV-Maximum bei 259 nm und mas-
senspektrometrisch durch die Massenzahl 149 nach-
gewiesen. Inosin konnte dünnschichtchromatogra-
phisch identifiziert werden. Nach Hydrolyse wurden
Hypoxanthin und 1-Methyladenin sowohl dünn-
schichtchromatographisch in zwei Laufmitteln als
auch durch die UV-Maxima bei 248 nm bzw. 260 nm
nachgewiesen. Aus Adenosinmonophosphat war
Hypoxanthin mit ca. \% Ausbeute zu erhalten. Bei
der Umsetzung von Adenin mit 14C-Methyl-NNMG
konnten neben 1-Methyladenin und 3-Methyladenin
auch 7V6-Methyladenin durch Co-Chromatographie
mit Vergleichssubstanzen und Messung der Radio-
aktivität nachgewiesen werden (Tab. 1). Diese Ver-
bindungen traten unter gleichen Reaktionsbedingun-
gen auch bei einer entsprechenden Umsetzung mit
Polyadenylsäure auf (Tab. 2). 3-Methyladenin wurde
kürzlich auch von L a w L e y 14 in NNMG-behandelter
DNS nachgewiesen.
Identifizierung
der
Methylierungsprodukte: Die
Identifizierung auf den Dünnschichtplatten wurde durch
Co-Chromatographie mit Vergleichssubstanzen verschie-
dener Herkunft an MN 400 in mehreren Laufmitteln
vorgenommen. Die bei 254 nm löschenden Substanz-
flecken wurden ausgekratzt und nach Rechromatogra-
phie in einem anderen Laufmittel die Radioaktivität
mit 7 ml Dioxan-Szintillator in einem Packard-Scintilla-
tion-Spectrometer gemessen.
Substanz
R f Werte und Aktivität in IpM
S2
S3
S10
Guanin
0,14
0,46
0,09
7-Methyl-
guanin
0,19
9,1 ± 0,8
0,64
9,6 ± 0,9
0,17
7,3 ± 0,8
Tab. 3. Methylierungsprodukt nach Behandlung von Poly-UG
(Bedingungen wie Tab. 1).
Substanz
Rf-Werte und Aktivität in IpM
S2
S10
S1
S3*
Cytosin
0,20
0,39
0,70
0,77
0,24
0,42
29,5 ± 1,1
3-Methyl-
cytosin
0,26
382
0,55
36,1 ± 1,2
47,4 ± 1,2
1-Methyl-
cytosin
0,15
0,64
8,3 ± 0,9
0,84
0,70
0,50
43,2 ± 1,2
fl44.
7,3 ± 0,6
0,58
l-Nitro-3-
methyl-
0,60
0,78
Derivate des Guanins
guanidin
Nach der Umsetzung des Guanins mit NNMG
sowohl bei 80° als auch bei Zimmertemperatur
wurde Xanthin dünnschichtchromatographisch und
durch das UV-Spektrum identifiziert. Aus Guanosin
konnte nach entsprechender Reaktion bei Zimmer-
temperatur bzw. 37° und bei pH 5,5 Xanthosin mit
Hilfe der Dünnschichtchromatographie nachgewiesen
werden. 7-Methylguanosin gab sich durch helle Fluo-
reszenz im UV-Licht bei 254 nm auf der Dünnschidit-
platte zu erkennen, und die Fluoreszenz ließ sich im
Gegensatz zu der des Guanosins durch Ammoniak-
dämpfe nicht löschen. Nach Hydrolyse und Tren-
nung an Dowex 50 wurden außerdem Xanthin und
7-Methylguanin gefunden. 7-Methylguanin ließ sich
*
System S 3 diente zur Vortrennung, Rechromatographie in
den übrigen Systemen.
Tab. 4. Methylierungsprodukte nach Behandlung von Cytosin
(Bedingungen wie Tab. 1).
Substanz
Cytosin
R i-Werte und Aktivität in IpM
S2 S3
SI
S10
0,20
0,15
19,8 ± 1,0 27,8 ± 0,4 92,7 ± 0,8 53,4 ± 0,8
0,38
0,70
0,24
1-Methyl-
cytosin
0,64
0,84
0,49
Tab. 5. Methylierungsprodukt nach Behandlung von Poly-C
(Bedingungen wie Tab. 1).
Unauthenticated
Download Date | 9/26/19 5:23 AM

zu erwägen. Das NNMG-Molekül bietet Hydroxyl-
ionen zwei Angriffspunkte, am N-Atom der Nitroso-
gruppe (1) und am Guanidin-C-Atom (2). Die eine
Reaktion (1), für die auch ein elektrophiler Angriff
eines H® am N1 in Frage kommt, führt zu 1-Nitro-
3-methyl-guanidin und salpetriger Säure bzw. Ni-
trit, wie sich beim Stehenlassen in Lösung zeigt. Die
zweite Reaktion (2) bedingt die Bildung des methy-
lierenden Agens, das vermutlich über ein Methyl-
nitrosamin, Methyldiazohydroxyd bzw. Methyl-
diazotat entsteht. Die Bildung des nicht faßbaren
Nitroharnstoffs ist aus dem Nitroguanylrest herzu-
leiten, der seinerseits Nitroguanylierungen an den
Nucleobasen vornehmen könnte. Entstandener Nitro-
harnstoff kann sich entweder selbst mit NNMG so-
fort umsetzen, wie in Versuchen festgestellt werden
konnte, oder in Form seiner Hydrolyseprodukte.
Hierbei entsteht vermutlich das von uns nachgewie-
sene Nitroguanidin.
Ausgangssubstanz (Reaktionspartner Reaktionsprodukte
des NNMG)
Derivate des Adenins
Adenin, Adenosin, Adenosinmono-
phosphat, Polyadenylsäure
Adenin, Adenosin, Adenosinmono-
monophosphat, Polyadenylsäure
Adenin, Polyadenylsäure
Adenin, Adenosin, Adenosinmono-
phosphat
1-Methyladenin
3-Methyladenin
2V76-Methyladenin
Hypoxanthin
Derivate des Guanins
Guanosin, Guanosinmonophosphat,
Polyuridylguanylsäure
Guanin, Guanosin
7-Methylguanin
Xanthin
Derivate des Cytosins
1-Methylcytosin
3-Methylcytosin
Cytosin, Polycytidylsäure
Cytosin
Tab. 6. Umsetzungsprodukte der Nucleobasen und ihrer Deri-
vate mit NNMG.
auch nach einer Reaktion von Guanosinmonophos-
phat mit NNMG nach Hydrolyse und Trennung über
Dowex 50 erhalten. Mit Hilfe von 14C-Methyl-NNMG
wurde 7-Methylguanin aus Polyuridylguanylsäure
nach Dialyse, Hydrolyse und Chromatographie ge-
funden (Tab. 3). 7-Methylguanin ist in jüngster Zeit
H
„ I
#Iiu0Ii\\
H*
W
b* &
V N=0
o 2 n — n = c —- Nn
» O 5N— N = C —
+ H # e I Q - N = d
I
I
\
^
CH3
H
NH2
3
von
NNMG festgestellt worden14. Ein Nachweis dieser
Verbindung in vivo gelang
L
a
w
L
e
y
in der DNS nach Behandlung mit
1-M ethyl-3-nitro-guanidin
(1)
C
r a d d o C k 15.
O ® H* ö+
N=C
*N— öle H*
rlb^N- °
Derivate des Cytosins
o 2 n - n = c —
n
^
— »■CbN— N— C = 0
+
HN.
\
'CH,
oh3
I
I
ch3
CH3
NH2
H
NH2
Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit Purinbasen
ließ sich nach einer Reaktion bei pH 5,5 mit NNMG
sowohl bei Cytosin als auch bei Cytidin weder bei
Zimmertemperatur noch bei 80° das erwartete Des-
aminierungsprodukt Uracil nachweisen. Dies stimmt
mit Ergebnissen unserer Untersuchungen des Ein-
flusses von NNMG auf die Matrizenaktivität der
Homopolyribonucleotide überein1. 1-Methylcytosin
und 3-Methylcytosin ließen sich in einem Reaktions-
gemisch von Cytosin mit 14C-Methyl-NNMG bei
pH 6 und 37° durch Co-Chromatographie nachwei-
sen (Tab. 4). Im Hydrolysat der umgesetzten Poly-
cytidylsäure konnte auf die gleiche Weise 1-Methyl-
cytosin identifiziert werden (Tab. 5).
Nitroharnstoff M eth yln itro s-
am in
M ethyldiazo-
hydroxyd bzw.
M ethyldiazotat
(2i1)
m
H# ° I Ö - N = N - C H
3
a)+u ^ r n = R— ch 3
— ~ n 2 + #ch3
11
lD = N — NH— CH-i
N = N— (
-Ü H 2
(2,2 )
Die Bildung eines Methyldiazohydroxyds nehmen
E m m e lo t et al.16 als Zwischenprodukt bei der Methy-
lierung durch V-Nitroso-V-methylurethan an (2,2).
Monomethylnitrosamin könnte dabei intermediär
auftreten. Ein Reaktionsmechanismus für NNMG
über Diazomethan ist nach unseren Versuchen bei
pH 5,5 —6,0 wenig wahrscheinlich, da sich Diazo-
methan lediglich bei pH 13 und 14 nachweisen läßt.
Zum Reaktionsmechanismus
Es ist allerdings von
M
e e r w e i n 1 7 eine alkoholyti-
sche Spaltung von V-Nitroso-V-methylurethan be-
kannt, bei der unter neutralen Bedingungen „naszie-
Für die Methylierungs- und Desaminierungsreak-
tion des NNMG sind hauptsächlich zwei Reaktionen
17 Patent der Schering-Kahlbaum AG, Erfinder H.
M E E b w E in ,
15 V. M . C r a d d o C k , Biochem. J. 106, 921 [1968].
C . 1933 I I 1758 [1933].
16 P. E M M E lo t, I. J.
M iz r a h i u . E . k r iE k , Nature [London]
193,1158 [1962],
Unauthenticated
Download Date | 9/26/19 5:23 AM

rendes Diazomethan“ mit Aldehyden und Ketonen
Nach unseren Ergebnissen scheint für die Muta-
tionsauslösung durch NNMG eine Methylierung in
reagieren soll. H e n r y 18 wies aber daraufhin, daß
bei NNMG unter den von McKay gewählten Ver- der Zelle nicht allein auf Grund einer einfachen Re-
suchsbedingungen, einer Umsetzung in wäßriger
Kalilauge 19, die Bildung von /V-Methyl-anilin über
einen Diazomethanmechanismus nicht erklärt wer-
den könne. Nach Versuchen von k r ie k und e m m e -
L o t 20 werden Nucleinsäuren auch durch ein Gemisch
von Methylamin und salpetriger Säure bei pH 4,0
methyliert. In diesem Reaktionsgemisch wird nach
a u s t in 21 über das Methyldiazoniumion ein Methyl-
kation freigesetzt, das die Nucleobasen methyliert.
Vermutlich trifft daher vor allem im sauren und neu-
tralen Bereich für NNMG Reaktion 2,2a zu. Hier ent-
steht das Methyldiazoniumion, das unter Stickstoff-
abspaltung das elektrophile Methylkation freisetzen
könnte. Durch jüngste Untersuchungen von L ij in s k y ,
Loo und Ross22 mit C2H3-Dimethylnitrosamin an
Ratten scheint diese Hypothese gestützt zu werden.
Sie zeigten, daß eine Methylierung zu 7-Methyl-
guanin über Diazomethan für dieses Nitrosamin
nicht in Frage kommt.
aktion von NNMG mit den Nucleobasen vorzuliegen.
Offensichtlich sind am Medianismus der Methylie-
rung Sulfhydryl-Verbindungen beteiligt, da in Ge-
genwart von SH-Verbindungen eine erhebliche Be-
schleunigung der Methylierungsreaktion beobachtet
werden konnte 23, 24.
Die Nitroguanylierung spielt wahrscheinlich bei
der Mutationsauslösung auch eine gewisse Rolle.
In diesem Zusammenhang ist erwähnenswert, daß
wir bei der Umsetzung von Phenol mit NNMG O-
Phenylisonitroharnstoff und entsprechend aus p-Kre-
sol O-p-Kresyl-isonitroharnstoff erhalten haben25.
Dem Fonds der Chemischen Industrie und der Deut-
schen Forschungsgemeinschaft danken wir für Unter-
stützung der Arbeit, Herrn Dr. J. H eiss und Herrn
K. P. Z e l le r (Tübingen) danken wir für Aufnahme
und Interpretation von Massenspektren.
18 R. A. h E n r y , J. Amer. chem. Soc. 72, 3287 [1950).
23 r . s üssM uth u. F. l in g En s, Naturwissenschaften 55, 85
19 A. F.
M
Ck a y , J. Amer. chem. Soc. 70, 1974 [1948].
[1968].
20 E .
k
r iE k u. P. E M M E lo t, Biochim. biophysica Acta [Amster-
24 R . S ü ssm u th u . F. L in g e n s, Veröffentlichung in Vorberei-
tung.
dam] 91, 59 [1964].
21 A . T. a u st in , Nature [London] 188, 1086 [I960].
22 W. l ij in s k y , J. l oo u. A. E . Ross, Nature [London] 218,
1174 [1968].
25 F. l in g En s u. J. r a u , unveröffentlicht.
Unauthenticated
Download Date | 9/26/19 5:23 AM