Solid phase synthesis of muramyl dipeptides on isomeric trialkoxybenzylamine resins

Festphasensynthese von Muramyldipeptiden an isomeren

Trialkoxybenzylamin-Harzen

Solid Phase Synthesis of Muramyl Dipeptides on Isomeric

Trialkoxybenzylamine Resins

Hans-Jürgen Kohlbaua, Jochen Tschakerta, Raed A. Al-Qawasmeha,

Tanveer Ahmad Nizami3, Abdul Malika **, Wolfgang Voelter3*

a Abteilung für Physikalische Biochem ie des Physiologisch-chem ischen Instituts der

Universität Tübingen, Hoppe-Seyler-Straße 4. D-72076 Tübingen

Z. Naturforsch. 53b, 7 53-764 (1998); received May 7, 1998

Muramyl Peptides, Solid Phase G lycopeptide Synthesis, Peptide A m ide Synthesis,

G lycopeptides

New isomeric trialkoxybenzylamine resins are developed coupling phthalimidomethyl-3,5-

dimethoxyphenols to the M errifield resin, follow ed by subsequent treatment with hydrazine.

The generated benzylamine function allows DCC coupling with the carboxyl function of

amino acids and peptides which are rem oved as amides after treatment with trifluoroacetic

acid. These new trialkoxybenzylamine resins allow expeditious syntheses of peptide amides

and glycopeptide amides as is dem onstrated for muramyl peptides and analogues.

Einleitung

und erfolgreich in der Festphasensynthese von

M DP (Glycopeptidamiden) verwendet.

Das N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin

(MDP) ist ein Fragment des Zellwandpeptidogly-

kans Murein von Bakterien. Seit längerem ist be-

kannt, daß das Muramyldipeptid (MDP) die klein-

ste Einheit ist, die eine Im m unantwort auslöst [1].

Eine markante Teilstruktur von M DP ist der in

Zellgeweben weniger häufige A m inosäurerest D-

Isoglutamin, welcher für die biologische Aktivität

der Verbindung [2-4] essentiell ist. Aufgrund der

biologischen Wirkung haben m ehrere A rbeits-

gruppen Synthesestrategien für M uramylpeptide

beschrieben [5-14].

Die im Folgenden dargestellte Synthese von

M uramyldipeptiden gliedert sich in vier Teilberei-

che: 1. Synthese der Ankergruppierungen mit

Kupplung des Ankers an das M errifield-Harz; 2.

Darstellung der Glykokomponenten; 3. Festpha-

sensynthese der Benzyl-N-acetyl-muramyldipep-

tidderivate und Abspaltung der Syntheseprodukte

vom Harz; 4. Entfernung der Schutzgruppen,

chromatographische Reinigung der Endprodukte

und deren spektroskopische Charakterisierung.

In unserer Arbeitsgruppe wurde ein Benzyl-

aminanker entwickelt, welcher sich hervorragend

zur Synthese von Peptidamiden eignet. Bei der

Ankerdarstellung durch Einführung von Methyl-

aminofunktionen in einen 3,5-Dimethoxyphenol-

kern entstehen vier Substitutionsprodukte (o; p;

o,o und o,p), die rein isoliert und charakterisiert

werden. Drei der vier Derivate werden mit dem

Chlormethyl-Harz (M errifield-Harz) umgesetzt

1. Synthese der Ankergruppen

Die Synthese der Ankergruppierung erfolgt

durch Reaktion von 3,5-Dimethoxyphenol mit N-

Chlormethylphthalimid in Gegenwart von wasser-

freiem Zinkchlorid. Bei dieser Friedel-Crafts-Al-

kylierung werden neben zwei Monoalkyl- zwei Di-

substitutionsprodukte gebildet. Eine dreifache

Substitution an 3,5-Dimethoxyphenol ist nicht zu

beobachten. Die Trennung der entstandenen Pro-

dukte ist durch Säulenchromatographie mit Chlo-

roform/Essigester (95:5, v/v) möglich. Es werden

so nacheinander 2-Phthalimidomethyl-3,5-dime-

thoxyphenol (la), 2,6-Di-(phthalimidomethyl)-

3,5-dimethoxyphenol (2a), 2,4-Di-(phthalimido-

* Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. Dr. h.c. W.

Voelter.

** On leave from H. E. J. Research Institute of Chem is-

try, University of Karachi, Karachi-75270, Pakistan.

D

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754

H.-J. Kohlbau et al. • Festphasensynthese von M uramyldipeptiden an isomeren Trialkoxybenzylamin-Harzen

methyl)-3,5-dimethoxyphenol (2b) und 4-Phthali-

midomethyl-3,5-dimethoxyphenol (lb) isoliert.

la

lb

3a-d

V

= Polystyrol mit 1% Divinylbenzol vernetzt

©

la: R^C Hj-Phthalim ido, R2, R3=H

lb: R3=CHj-Phthalimido, R 1( R2=H

2a: Rj, Rj=CH2-Pbthalimido, R3=H

2b: R 1( R3=CH2-Phthalimido, Rj=H

3a: R4=CHjNH1, R,, R,=H

Schema 1. Reaktion von 3,5-Dim ethoxyphenol mit N-

Chloromethylphthalimid in Gegenwart von Zinkchlorid.

3b: R ^C H jN H j, R^, Rj=H

3c: R<, R5=C BjNHj, R«=H

3d: R4, R4=CHjNH2, R,=H

Es werden die Verbindungen la und lb an ein

Ftarz mit 1,34 mmol Chlormethylgruppen pro

Gram m und die Produkte 2a und 2b an ein Harz

mit 0,75 mmol Chlormethylgruppen pro Gram m

unter Basenzusatz (Natriumm ethanolat) geknüpft.

Durch anschließende Hydrazinolyse wird die Ben-

zylaminoankergruppe dargestellt. Die so erhalte-

nen polymeren Träger (3a-d) werden für die Fest-

phasensynthese eingesetzt, wobei die Kupplungs-

effizienz durch den Ninhydrintest nach Kaiser [15]

überprüft wurde.

Schem a 2. Kupplung der Ankerverbindungen la, lb, 2a,

2b an das M errifield-Harz und anschließende Hydrazi-

nolyse zur Darstellung von 3a-d.

Trennung sehr gut UV-spektroskopisch bei 254 nm

detektieren. Aufgrund des anomeren Effekts ent-

steht das a-A nom ere, das aufgrund der äquatoria-

len Stellung der Substituenten in der 4C r Konfor-

m ation vorliegt, wie auch die NM R-Daten bestäti-

gen [18]. Die nachfolgende Umsetzung des Ben-

2. Darstellung der Zuckerkomponenten

Die Synthese der am anomeren C-Atom und an

C-4 und C-6 blockierten V-Acetyl-muraminsäure

(6) erfolgt in einer dreistufigen Reaktion. N-

Acetyl-glucosamin wird nach Fischer benzyliert

[16,17], Die Benzylierung wird deshalb gewählt,

zylglykosids

4

zum

Benzyl-V-acetyl-4,6-0-

benzylidenderivat 5 erfolgt mit a,a-Dimethoxyto-

luol in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure [19]. 5

wird dann mit D,L-a-Chlorpropionsäure unter Z u-

satz von Natriumhydrid umgesetzt. Trotz des Ein-

weil die Benzylschutzgruppe unter milden Bedin- satzes der razemischen Säure, entsteht bei der ste-

gungen hydrogenolytisch abgespalten werden reoselektiven Reaktion hauptsächlich das Mura-

kann. Außerdem lassen sich Substanzen mit aro- m insäurederivat mit einem D-Lactylrest. Das als

matischen Systemen bei chromatographischer

N ebenprodukt entstehende L-Isomere (ca. 5%)

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755

kann durch Umkristallisation aus heißem M etha- M assenspektrom etrie größtenteils identifiziert. In

nol vom D-Isomeren abgetrennt werden [20,21],

Abb. 2 sind die RP-HPLC-Chromatogramme der

Syntheseprodukte und in Tab. I die Zuordnungen

verschiedener Fraktionen zu Haupt- bzw. N eben-

produkten mittels FAB-MS zusammengestellt.

ho-V^C»^H—^jOHo

CHjOH

HOHjCPb

-

^HO-^—---------^—--^O-

-

------------

[HCl]

AcHN I

OCHjPh

AcHN

|pb-CH (OM e)2

Gewinnung der Syntheseprodukte

CI

a. Benzyl-N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-

isoglutamin (7a)

I

HX-CH-COOH

Ph'o-

C H j-CH ^

AchN 0CH2Ph NaH

AcHN OCH2Ph

7a wird nach dem allgemein beschriebenen Syn-

theseschema 2 auf dem Harz 3a dargestellt. Die

A bspaltungsreaktion wird 1,5 h lang durchgeführt.

Das R ohprodukt wird durch RP-HPLC aufgerei-

nigt (Abb. 2), und das H auptprodukt sowie einige

Nebenprodukte werden durch FAB-MS identifi-

ziert (Tab. I). Wie aus Tab. I zu sehen ist, fallen

neben dem gewünschten H auptprodukt N eben-

produkte an, bei denen keine komplette Abspal-

tung der Schutzgruppen erfolgte. Ein Teil des

H auptproduktes wird bei der Abspaltung zu Ben-

zyl-N-acetyl-muraminsäure hydrolysiert. Darüber-

hinaus wird das Isomuramylderivat gefunden. Die

Identifizierung des Reinproduktes Benzyl-N-

acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (7a) er-

folgt durch 'H-NM R-Spektroskopie und M assen-

spektrom etrie.

COOH 6

Schema 3. Darstellung von Benzyl-/V-acetyl-2-amino-2-

desoxy-4,6-0-benzyliden-3-0-(D -l-carboxyethyl)-a-D -

glucopyranosid (6) aus N-Acetylglucosam in.

3. Festphasensynthese

Die Festphasensynthesestrategie, wonach sämt-

liche Möglichkeiten an enantiom eren A m inosäu-

rekombinationen dargestellt wurden, ist aus

Abb. 1 ersichtlich.

■y-iBuO-Qu

Ala

B z-N -A c-M ur,

— NH-,

H O -

■Fmoc

-Fmoc

Piperidin

■NH,

H O -

-Fmoc

DCC/HOBt

-Fmoc

Piperidin

-N H ,

b. Benzyl-N-acetyl-muramyl-L-alanyl-L-

isoglutamin (7b)

H O -

- Benzyiiden

- Bcazyiiden

I TFA/Thioanisol

Die Synthese des L-Isoglutamin-Diastereome-

ren von M DP erfolgt ebenfalls auf dem Harz 3a.

Die Abspaltung vom Harz erfolgt hier in 2 h, um

den Anteil an nicht vollständig deblockiertem Pro-

dukt zu verringern. Das nach der Abspaltung er-

Bz-N-Ac-Mur-Ala-isoGln

Abb. 1. Festphasensyntheseschema zur Darstellung von

Benzyl-/V-acetyl-muramyl-alanyl isoglutamin.

Die Kupplung wird mit D CC/HOBt durchge- haltene R ohprodukt wird mittels RP-HPLC gerei-

führt. Die Abspaltung der tem porären Fmoc-

Gruppe erfolgt mit Piperidin in DMF. Jeder Kupp-

lungsschritt wird durch den Ninhydrintest [15] auf

Vollständigkeit überprüft. Die Abspaltung der ge-

schützten Zielverbindung erfolgt mit TFA unter

Zusatz von Thioanisol. Die Zeiten für die Abspal-

tungsreaktionen sind unterschiedlich und liegen

zwischen 1,5 h und 5 h. Die Isolierung der Rein-

produkte erfolgt durch HPLC und die C harakteri-

sierung hauptsächlich durch 'H-NM R-Spektros-

kopie und Massenspektrometrie. Die neben dem

Hauptprodukt bei der Synthese entstandenen Ne-

benprodukte werden ebenfalls isoliert und durch

nigt (Abb. 2), und das H auptprodukt sowie einige

N ebenprodukte werden durch FAB-MS identifi-

ziert (Tab. I). Durch Verlängerung der Abspal-

tungsreaktionszeit ist, im Gegensatz zur Synthese

von 7a, der Anteil an unvollständig deblockierten

Benzyl-N-acetyl-muramyl-L-alanyl-L-isoglutamin-

D erivaten geringer, gleichzeitig beobachtet man

jedoch einen Anstieg des Hydrolyseproduktes

Benzyl-N-acetyl-muraminsäure. Außerdem wird

hier das Isomuramylderivat isoliert. Die Identifi-

zierung des Reinproduktes Benzyl-N-acetyl-mura-

myl-L-alanyl-L-isoglutamin (7b) erfolgt durch 'H -

NM R-Spektroskopie und M assenspektrometrie.

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hoA . 0

c. Benzyl-N-acetyl-m uram yl-D-alanyl-L-

isoglutamin (7c)

ch3- c A

AcHN OCH2Ph

c=o

Die Synthese dieses M DP-Derivates wird auf

dem Harz 3d durchgeführt. Die Abspaltung vom

Harz erfolgt innerhalb von 3,5 h. Das nach der

Abspaltung erhaltene Rohprodukt wird mittels

RP-HPLC gereinigt (Abb. 2), und das H auptpro-

dukt sowie einige Nebenprodukte werden durch

FAB-MS identifiziert (Tab. I). Bei der Synthese

entsteht zu einem geringen Teil Benzyl-N-acetyl-

NH

0

\i ii

n

CH-C-NH-CH-CH,-CHr COOH

'

I

CHj

CONH2

i

L

n

D

7a

7b

7c

7d

L

D

L

D

muramyl-D-alanyl-L-glutaminsäure.

N ebenpro-

dukte, die auf unvollständige Deblockierung bei

der Abspaltung schließen lassen, treten kaum auf.

Der Gehalt der durch Hydrolyse entstandenen

Benzyl-A^-acetyl-muraminsäure ist im Vergleich zu

den anderen Synthesen gestiegen. Die R etentions-

zeit des Isomuramylderivats weicht nicht sehr

stark von der des H auptprodukts ab, so daß hier

das L-Isomere nur als Schulter des H auptprodukt-

peaks im HPLC Chromatogramm beobachtet

wird. Die Identifizierung des Reinproduktes

Benzyl-N-acetyl-D-alanyl-L-isoglutamin (7c) er-

folgt durch 'H-NM R-Spektroskopie und M assen-

spektrometrie.

Schema 4. Struktur der isomeren Benzyl-yV-acetyl-mura-

myl-alanyl-isoglutamin (7a-d).

auf Aktivkohle als Katalysator entfernt, wobei die

freien N-Acetyl-muramyldipeptide 8a-d entste-

hen. Alle vier Derivate fallen bei den Hydrierun-

gen in hoher Reinheit an.

c=o

NH O

S1 U

n

^CH-C-NH-CH-CHj-CHj-COOH

CHj

CONH2

d. Benzyl-N-acetyl-m uram yl-D-alanyl-D-

isoglutamin (7d)

i

L

n

D

8a

Die Synthese dieses M DP-Derivates erfolgt auf

dem Harz 3b. Das Rohprodukt wird nach 5h A b-

spaltung isoliert. Neben dem H auptprodukt fallen

kaum Nebenprodukte an (Abb. 2; Tab. I). Nach

fünfstündiger Abspaltung ist kein unvollständig

deblockiertes Derivat zu detektieren. Fernerhin

tritt unter diesen Bedingungen kein Isomuramyl-

derivat auf. Die Identifizierung des Reinproduktes

Benzyl-N-acetyl-muramyl-D-alanyl-D-isoglutamin

(7d) erfolgt durch 'H-NM R-Spektroskopie und

Massenspektrometrie.

8b

8c

8d

L

D

L

D

Schema 5. Struktur der isomeren N-Acetyl-muramyl-

alanyl-isoglutamin Derivate (8a-d).

Werden die entstandenen Produkte durch

HPLC getrennt, dann zeigen sämtliche Verbin-

dungen je zwei Peaks mit einer charakteristischen

Intensitätsverteilung von ca. 1:2. Nach Trennung

der beiden Fraktionen und Rechromatographie

derselben werden identische Chromatogramme

erhalten. Durch M utarotation liegt ein Gleichge-

wicht zwischen den a- und /3-Anomeren im Ver-

hältnis von 2:1 vor [22-23], wie in Abb. 3 am Bei-

spiel von /V-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isogluta-

min (8a) gezeigt wird.

Alle vier Benzyl-iY-acetyl-alanyl-isoglutamin-

Isomeren (7a-d) zeigen ähnliche 'H-NM R-Spek-

tren und besitzen ähnliche Retentionszeiten im

HPLC.

Darstellung und Charakterisierung der

N-Acetylmuramyldipeptide (8a-d)

Wie diese Beispiele zeigen, eignet sich beson-

ders die A nkergruppe 3d hervorragend für die

Festphasensynthese von Glykopeptidamiden oder

Peptidamiden, welche durch „klassische“ M etho-

Die Benzylgruppe der Benzyl-/V-acetyl-mura-

myldipeptid-Isomeren 7a-d wird durch katalyti-

sche Hydrierung mit Wasserstoff und Palladium

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757

D)

1-»

<-2

L>

J

10

20

30

t(min)

Abb. 2. RP-HPLC von Rohprodukten, der durch Festphasensynthese erhaltenen enantiom eren M DP-Derivate

(7a-d), nach ihrer acidolytischen (TFA/Thioanisol; 95:5) Abspaltung vom Harz. Chromatogramme: A: 7a; B: 7b;

C: 7c; D: 7d. Chromatographische Bedingungen: Säule: Li-Chrospher® RP-18 5 ^m; Eluenten: A: 0.05% TFA in

H ?0 (v/v), B: TFA /H 20 /C H 3CN 0.05:40:60 (v/v); Gradient: 0 -1 min (95% A ), 1 -3 1 min (95-5% A); Flußrate 1 ml/

min; D etektion bei X = 214 nm.

gital Melting Point A pparatur der Firma Bachofer,

Reutlingen, gemessen. Sie sind nicht korrigiert.

Die D rehw erte werden mit einem LEP-A Z Polari-

m eter der Firma Zeiss, Jena, ermittelt. Die Ele-

m entaranalysen werden mit einem CHN-O-RA-

PID -G erät der Firma Heraeus, Hanau, durchge-

führt. Für die Dünnschichtchromatographie wer-

den DC-Fertigplatten, beschichtet mit Kieselgel 60

den nur über eine Vielzahl von Synthesestufen zu-

gänglich sind.

Experimentelles

Schmelzpunkte werden mit einer Schmelz-

punktbestim mungsapparatur nach Dr. Tottoli der

Firma Büchi (Büchi 510), Schweiz, oder einer D i-

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758

H.-J. Kohlbau et al. ■Festphasensynthese von Muramyldipeptiden an isomeren Trialkoxybenzylamin-Harzen

Tab. I. Identifizierung von Haupt- und ausgewählten Nebenfraktionen in den RP-HPLC-Chromatogrammen (siehe

Abb. 2) mit Hilfe von FAB-M S (Gerät: Varian MAT-711 der Firma Finnigan. Brem en), unter Angabe von R eten-

tionszeiten. m /z-Werten und Strukturzuordnungen.

Strukturzuordnung

Fraktion

Nr.

Retentions-

zeit (min)

Chromato-

gramm

m /z

(FAB-M S)

17.4

583.9

Benzy-N-acetyl-muramyl-L-analyl-

D-isoglutamin (7a), [M +H]+

A

1

Isomuramylderivat

M (7a)-(-L -A la-D -iG lu)

M (7a)+(-tBu)

583.9

384.1

639.5

583.3

2

3

4

1

18.29

20.95

27.48

1686

Benzy-N-acetyl-muramyl-L-alanyl-

L-isoglutamin (7b), [M +H]+

B

C

Isomuramylderivat

583.3

384.1

584.3

2

3

1

17.61

18.23

17.32

M (7b) - (-L-Ala-L-iGlu)

Benzy-N-acetyl-muramyl-D-alanyl-

L-isoglutaminsäure

Benzy-N-acetyl-muramyl-D-alanyl-

L-isoglutamin (7c), [M +H]+

583.2

2

18.25

Isomuramylderivat

18.52

22.13

17.52

583.2

384.2

583.2

3

4

1

M (7c) - (-D-A la-L-iGlu)

Benzy-N-acetyl-muramyl-D-alanyl-

D-isoglutam in (7d), [M +H]+

D

Isomuramylderivat

583.1

2

18.30

Abb. 3. HPLC des synthetischen /V-Acetyl-

muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (8a). B: Re-

chromatogramm der Fraktion Nr.l von A nach

30-minütigem Stehen im Eluenten. C: Rechro-

matogramm der Fraktion 2 von A nach 1-stün-

digem Stehen im Eluenten. Chromatographi-

sche Bedingungen: Säule: LiChrospherR RP-

18 5 (.im; Eluenten: A: 0.05% TFA in H 20 (v/

v). B: T F A /H ,0/C H ,C N 0.05:40:60 (v/v); Gra-

dient: 0 -1 min (95% A ),l-3 1 min (95-5%

A); Flußrat 1 ml/min: Detektion bei X=214 nm.

—V

- r

20

30

20

30

10

30

t [min]

t [mm)

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H.-J. Kohlbau et al. • Festphasensynthese von Muramyldipeptiden an isomeren Trialkoxybenzylamin-Harzen

759

F254, der Firma Merck, D arm stadt, benutzt. Fol- Die Chlormethyl-Harze (M errifield-Harze) mit

gende Laufmittelsysteme w erden verwendet (je- der Beladung von 0.75 mmol/g bzw. 1.34mmol/g

weils v/v): A = M eOH/EE (1:4), B = n-BuOH/ sind Produkte der Firma Bio-Rad, München.

H 20 /A c 0 H (4:1:1), C = CHC13/EE (95:5), D =

CHCI3/ M e0H /C 6H6/H20 (8:8:8:1). Die Chrom a-

togramme werden mit UV-Licht bei X = 254 nm

visualisiert und/oder durch Ninhydrin oder Chlor-

toluidin angefärbt.

Fmoc-Aminosäuren wurden von der Firma Ba-

chem, Heidelberg und alle weiteren hier nicht auf-

geführten Chemikalien von der Firma Merck,

Darmstadt, bezogen.

Selbstgepackte Säulen mit Kieselgel 60 (63-

200 //m Korngröße) der Firma Merck, Darmstadt,

werden für die Reinigung der Produkte verwen-

det. Zur präparativen HPLC-Trennung der R oh-

produkte wurde folgende Einheit verwendet: BT-

8100 Pumpe, BT-8200 H PLC UV/VIS Detektor,

C-R6A CHROM ATOPAC-Integrator (alle G e-

räte von der Firma Eppendorf Biotronik, Maintal)

und eine SS 250 Vi“ / 10 Nucleosil® 7 C 18-Säule

(Macherey-Nagel, Düren). Zur analytischen

Ü berprüfung der Reinheit wird folgende HPLC-

Anlage eingesetzt: BT-8100 Pumpe, BT-8200

HPLC UV/VIS D etektor, BT-8300 System-Con-

troller, C-R6A CHROM ATOPAC-Integrator (alle

Geräte von der Firma Eppendorf Biotronik, Main-

Darstellung der Ankergruppierungen für die

Festphasensynthesen

Reaktion von 3,5-Dim ethoxyphenol m it

N-Chlorm ethylphthalim id

3.08

g (0.02 mol) 3,5-Dimethoxyphenol und

3.91 g (0.02 mol) /V-Chlormethylphthalimid wer-

den in 50 ml Benzol gelöst und dann wird 0.27 g

(0.004 mol) ZnCl2 (wasserfrei) zugegeben [24].

Das Gemisch wird 18 h bei R.T. gerührt. Nach die-

ser Zeit werden nochmals 0.27 g ZnCl2 zugegeben,

und es wird für weitere 5 h bei Raumtemp. ge-

rührt. Nach Entfernung des Benzols im Vakuum

wird der Rückstand in 100 ml Chloroform gelöst

und dreimal mit je 100 ml Wasser gewaschen.

Nach Trocknung der organischen Phase über N a-

triumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt und der Rückstand mit Toluol/Petrolether

(1:2, v/v) gewaschen. Die entstandenen Friedel-

Crafts-Alkylierungsprodukte werden über eine

selbstgepackte Kieselgelsäule chromatographisch

getrennt. Als Elutionsm ittel wird ein Chloroform/

Ethylacetat-Gemisch (95:5, v/v ) verwendet. Fol-

gende vier Produkte werden nacheinander isoliert:

2-Phthalimidomethyl-3,5-dimethoxyphenol (la),

2,6-Di-(phthalimido-methyl)-3,5-dimethoxyphenol

(2a), 2,4-Di-(phthalimidomethyl)-3,5-dimethoxy-

phenol (2b) und 4-Phthalimidomethyl-3,5-dime-

thoxyphenol (lb).

tal) und eine LiChrospher® 100 RP-18, 5

(4 x

250 mm) Säule (Merck, D arm stadt). Zur Auf-

nahme der IR-Spektren werden KBr-Presslinge

hergestellt, die 1 mg Substanz pro 200 mg KBr

enthalten. Die Messung erfolgt mit dem G erät Ac-

culab1

4 der Firma Beckman, München. Für die

Aufnahme der NM R-Spektren werden folgende

G eräte der Firma Bruker, Karlsruhe, eingesetzt:

Bruker AC-250 (’H-NMR: 250 MHz; 13C-NMR:

63 MHz) und Bruker WM-400 (’H-NMR: 400

MHz; 13C-NMR: 100 MHz). Als interner Standard

dient Tetramethylsilan. D ie FD- und FAB-Mas-

senspektren werden mit dem Varian MAT-711 der

Firma Finnigan, Bremen, aufgenommen. Hydrie-

rungen erfolgen in einer H ydrierapparatur der

Firma Bachofer, Reutlingen. Als Lösungsmittel

dient M ethanol mit katalytischen Mengen Essig-

säure. D er W asserstoffdruck wird auf 2.5 atm ein-

gestellt. Als H ydrierkatalysator wird 10% Palla-

dium auf Aktivkohle der Firma Merck, D arm -

stadt, verwendet. Die Lösungsmittel werden nach

den üblichen Vorschriften getrocknet und über

eine 140 cm Vigreuxkolonne destilliert. Die Auf-

bewahrung erfolgt über einem 4 A Molekularsieb

(Fa. Merck, Darm stadt).

Gesamtausbeute: la, lb, 2a und 2b: 89%.

2-Phthalim idom ethyl-3,5 -dimethoxyphenol (la):

Ausb. 2.4 g (32%), farblose Kristalle, Schmp.:

161 °C (Lit. [25] 168 °C), R°f = 0.52; IR (KBr), vmax

(cm“1): 3280, (O H ), 2960/ 2850, (CH), 1700 / 1770

(C = 0), 1600 (C=C), 900 / 800 (CH aromat); !H

NM R (CDCI3): ö = 8.38 (s, 1H, O H ), 7.86-7.62

(m, 4H, aromat. H), 6.13 (d, J0tP = 2.4 Hz, 1H, o-

98 (d, Jp 0 = 2.4 Hz, 1H, p-H phenol), 4.76

Elphenol.)*

(s, 2H, CH2), 3.74 (s, 3H, OM e), 3.69 (s, 3H, OMe);

FD-MS, m /z (rel. Int): 313.5 (100) [M]+, 156.3 (18)

[M]2+.

Natriumhydrid (80-proz. Suspension in Paraf-

fin) und p-Toluolsulfonsäure werden von der

Firma Merck, D arm stadt, bezogen. /V-Acetylglu-

cosamin, A^V-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N-

Hydroxybenzotriazol (H O B/), Thioanisol, 3,5-Di-

m ethoxyphenol und /V-Chlormethylphthalimid

sind Produkte der Firm a Fluka, Buchs, Schweiz.

C 17H 15N 0 5 (313.31)

Ber. C 65.18 H 4.79 N 4.47% ,

Gef. C 64.64 H 4.94 N 4.91% .

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760

H.-J. Kohlbau et al. ■Festphasensynthese von M uramyldipeptiden an isomeren Trialkoxybenzylamin-Harzen

4-Phthalim idom ethy 1-3,5-dim ethoxyphenol

Ausb. 1.6 g (22% ), farblose Kristalle, Schmp.:

204 °C (Lit. [24] 204 °C); = 0.09: IR (KBr), vmax

(lb):

gerührt. 0.9 g (2 mmol) 2a bzw. 2b werden jeweils

mit 0.5 g (9.3 mmol) Natrium m ethylat und 2 g des

Merrifield-Harzes (Beladung 0.75 mmol/g) in

( c m 1): 3460 (O H ), 2940/ 2840 (CH), 1700 / 1760 20 ml DMF bei 60 °C 18 h lang gerührt. Nach den

einzelnen Kupplungsreaktionen werden die Harze

filtriert und mit DMF, M eO H und DCM in dieser

Reihenfolge dreimal gewaschen. Die Harze wer-

den in 20 ml EtO H suspendiert und mit 10 ml H y-

drazinhydrat 18 h bei 85 °C unter Rückfluß ge-

kocht. Danach werden die Harze abgesaugt und

mit DMF, M eOH und DCM gewaschen (jeweils

dreimal). Nach Trocknung im Vakuum wird die

freie Aminogruppe mittels Ninhydrintest [15] de-

tektiert; Ausb. (bezogen auf den theoretischen

Massenzuwachs bei quantitativer Einführung der

Ankereinheit): 1.81 g 2-Benzyloxy-4,6-dimethoxy-

benzylamin-Harz (3a; 80%), 1.74 g 4-Benzyloxy-

2,6-dimethoxy-benzylamin-Harz (3b; 77%), 1.63 g

2-Benzyloxy-4,6-dimethoxy-3-methylamin-benzyl-

amin-Harz (3c; 72%) und 1.72 g 4-Benzyloxy-2,6-

(C = 0), 1600 (C=C), 900 / 810 / 700 (CH aromat);

'H -N M R (CDC13): (3 = 7.79-7.63 (m, 4H, aromat

H), 6.01 (s, 2H, o-H phenol o-H phenol), 4.85 (s, 2H,

CH 2), 3.72 (s, 6H, OMe); FD-MS m /z (rel. Int.):

313.5 (100) [M]+.

C 17H lsN O , (313.31)

Ber. C 65.18 H 4.79 N 4.47% ,

Gef. C 64.89 H 4.98 N 5.13% .

2,6-D i-(phthalim idom ethy l)-3,5-dim ethoxyphenol

(2a): Ausb. 0.9 g (16%), hellgelbe Kristalle,

Schmp.: 201 °C (Lit. [24] 209 °C), Rj = 0.32; IR

(KBr), vmax (cm -1): 3260 (OH), 2940 / 2850 (CH),

1690 / 1780 (C = 0), 1600 (C=C), 900 / 810 / 710

(CH aromat); ’H-NM R (CDCI3): (3 = 8.59 (s, 1H,

OH), 7.92-7.65 (m, 8H, aromat. H), 6.04 (s, 1H, dimethoxy-3-methylamin-benzylamin-Harz

(3d;

76%).

p-Hphenoi), 4.89 (s, 4H, CH 2), 3.79 (s, 6H, OMe);

FD-MS, m /z (rel. Int.): 472.3 (100) [M]+.

C26H 2()N20 7 (472.45)

Darstellung von Benzyl-N-acetyl-2-am ino-2-

desoxy-4,6-0-benzyliden-3-0-(D -l -carboxyethyl)-

a-D-glucopyranosid (6)

Ber. C 66.10 H 4.24 N 5.93% ,

Gef. C 65.79 H 4.85 N 6.31% .

2,4-D i-(phthalim idom ethyl)-3,5-dim ethoxyphenol

(2b): Ausb. 1.1 g (19% ), gelbe Kristalle, Schmp.:

183 °C (Lit. [24] 189 °C), R°f = 0.19; IR (KBr), vmax

(cm “ 1): 3460 (O H ), 2960 / 2860 (CH), 1700 / 1760

(C = 0), 1600 (C=C), 900 / 820 / 720 (CH aromat);

'H -N M R (CDCI3): (3 = 7.86-7.63 (m, 8H, aromat.

H), 6.34 (s, 1H, o-H phenol), 4.85 (s, 2H, CH 2), 4.82

(s, 2H, C H 2), 3.98 (s, 3H, OM e), 3.74 (s, 3H, OMe);

FD-MS, m /z (rel.Int.): 472.3 (100) [M]+.

Benzyl-N-acetyl-D-glucosam in (4): In 115 ml

Benzylalkohol wird solange HCl-Gas eingeleitet,

bis eine 2-proz. Lösung (w/w) entsteht. Anschlie-

ßend werden analog Lit. [17] 10 g (0.045 mol) N-

Acetylglucosamin zugegeben und die Lösung 3 h

bei 100 °C unter Rückfluß gekocht. Zu der nun

dunkelbraunen Lösung werden 100 ml Benzol ge-

geben. Diese Mischung tropft man unter starkem

Rühren zu 320 ml abs. Ether, wobei sich eine

leicht bräunliche Kristallmasse abscheidet. Das

ausgefallene Rohprodukt wird über eine Glasfritte

abgesaugt und mit Ether gewaschen. Nach Trock-

nung über N aOH wird das Produkt aus heißem

Ethanol umkristallisiert; Ausbeute 11g (78%),

weiße Kristalle, Schmp.: 178 °C (Lit. [17] 180 °C);

[a]D = +153.7° (c = 1 in Wasser) {Lit. [17] +158°

(c = 1 in Wasser)}; R °f = 0.63; IR (KBr), vmax

(cm “ 1): 3300 (OH), 3050 / 2940 (CH), 1650 (C=

O); ‘H-NM R (DM SO-d6): (3 = 7.79 (d, 7NH2 =

8.32 Hz, 1H, NH), 7.32 (m, 5H, aromat. H), 5.00

(d, J X2 =5.32 Hz, 1H, 1-H), 4.69 (d, Jgem =

12.12 Hz, 1H, PhC //H '), 4.66 (d, 1H, PHCH/ / ’),

4.42 - 4.39 (m, 2H, 3-OH, 4-OH), 4.33 (t, JOH c h 2 =

5.00 Hz, 1H. 6-OH), 3.46-3.41 (m, 6H, 2-H, 3-H,

4-H. 5-H. 6-H. 6'-H), 1.82 (s, 3H, CH ,); 13C-NMR

(DM SO-d6): (3 = 174.9 CAmid, 143.4, 133.6, 133.0,

132.9 Caromat, 101.4 C -l, 78.6 C-5, 76.4, 76.1 C-3/

C26H 20N2O 7 (472.45)

Ber. C 66.10 H 4.24 N 5.93% ,

Gef. C 65.75 H 4.79 N 5.52% .

Kupplung der Ankergruppen m it dem Polystyrol-

harz und anschließende H ydrazinolyse

Die Verbindungen la, lb, 2a und 2b werden auf

ein Chlorm ethyl-Harz (M errifield-Harz) gekup-

pelt. Die Beladung des Harzes für die Reaktion

mit la und lb beträgt 1.34 mmol Chlormethyl-

gruppen pro Gramm Harz, die Beladung des H ar-

zes bei der Reaktion von 2a und 2b beträgt

0.75 mmol/g. Die Reaktionen werden nach Lit.

[24] durchgeführt: Jeweils 0.94 g (3 mmol) la bzw.

lb werden mit 0.8 g (14.8 mmol) Natriummethylat

und 1.9 g des M errifield-Harzes (Beladung

1.34 mmol/g) in 20 ml DM F bei 60 °C 18 h lang

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H.-J. Kohlbau et al. ■Festphasensynthese von M uramyldipeptiden an isomeren Trialkoxybenzylamin-Harzen

761

C-4, 73.2, 66.3 C-6, C Benzyh 59.23 C-2, 28.0 CMe; werden zu einer Lösung von 4 g (0.01 mol) 5 in

FAB-MS, m /z (rel. Int.): 312.2 (78) [M+H]+, 204.0 200 ml 1,4-Dioxan bei 60 °C 0.6 g (0.02 mol) Natri-

(100) [M+H-Benzylalkohol]+.

umhydridsuspension (80-proz. in Paraffin) gege-

ben. Das Gemisch wird auf 95 °C erwärm t und bei

dieser Temperatur 1 h gerührt. Nach Abkühlung

auf 60 °C werden 4.4 g (0.04 mol) ±-a-C hlorpro-

pionsäure zugetropft. Dabei fällt eine große

Menge fein kristallines Natriumchlorid aus, so daß

das Gemisch erst wieder nach ca. 10 min gerührt

werden kann. Dann werden nochmals 1.5 g (0.05

mol) der Natriumhydridsuspension vorsichtig zu-

gegeben und das Gemisch 18 h bei 60 °C gerührt.

Zur Aufarbeitung werden vorsichtig unter Eisküh-

lung 200 ml Wasser zugegeben. Nach zweimaligem

Waschen mit n-Hexan wird die Lösung mit 6 N

HCl auf pH 3 angesäuert. Dabei fällt das Produkt

als farblose Kristallmasse aus. Das Rohprodukt

wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Nach

Trocknung über P20 5 wird aus heißem M ethanol

umkristallisiert, wobei das entstandene L-Isomere

abgetrennt werden kann; Ausb. 3.5 g (74% ), farb-

lose Kristalle, Schmp.: 241 °C (Lit. [21] 243 °C);

[a]D = +104.8° (c = 1 in M ethanol) {Lit. [21] +98°

(c = 1 in Methanol)}; Ff} = 0.54; IR (KBr), vmax

(cm “1): 3300 (OH), 3080 (CH aromat), 2940 (CH),

1720 (C = 0 Saure), 1650 (C = 0 Amid) cm “ 1; ‘H-NM R

(DM SO-d6): (3 = 7.53-7.32 (m, 11H, aromat. H,

NH), 5.58 (s, 1H, H acetalisch), 4.90 (d, J l2 = 3.84 Hz,

1H, 1-H), 4.74 (d, / gem = 11.54 Hz, 1H, P hC //H '),

4.60 (d, / gem = 11.54 Hz 1H, P h C H //’), 4.29-3.75

(m, 7H, 2-H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 6’-H, H Lactyl),

1.98 (s, 3H, M eAcety,), 1.33 (d,

C 15H 21N 0 6 (311.33)

Ber. C 57.88 H 6.75 N 4.50% ,

Gef. C 56.94 H 6.60 N 4.02% .

Benzyl-N -acetyl-2-am ino-2-desoxy-4,6-0-benzyl-

iden-a-D -glucopyranosid (5): 1 g /?-Toluolsulfon-

säure x H 20 wird durch mehrmaliges Lösen in

Aceton/Toluol mit anschließendem Abziehen des

Lösungsmittels sämtliches Kristallwasser entzogen

und dadurch wasserfreie p-Toluolsulfonsäure ge-

wonnen. Nun wird analog der Vorschrift zur D ar-

stellung von Daunosam in [19] verfahren: Im

500 ml Rundkolben mit Blaugel/CaCl2-Trocken-

rohr werden 10 g (0.032 mol) 4 in 200 ml DM F mit

5.86 g (0.038 mol) a,a-D im ethoxytoluol und 0.12 g

(0.7 mmol) p-Toluolsulfonsäure (wasserfrei) bei

70 °C erhitzt. Nach 3 h ist die Reaktion abge-

schlossen (DC-Kontrolle) und das Reaktionsge-

misch wird zu 500 ml Eiswasser, welches 4 g

N aH C 03 enthält, unter starkem Rühren getropft.

Dabei fällt eine voluminöse Kristallmasse aus.

Nach Absaugen und Waschen mit Wasser wird das

Produkt erst an Luft und anschließend über P20 5

getrocknet; Ausb. 10.5 g (82% ), bräunliche Kri-

stalle, Schmp.: 254 °C (Lit. [25] 257 °C), [a]£°

+114° (c = 1 in Pyridin) {Lit. [26] +114° (c = 1 in

Pyridin)}; Ff} = 0.81; IR (KBr), vmax (cm “1): 3300

(OH), 3040 / 3070 (CH), 2950 (CH), 1645 (C =0);

'H -N M R (DM SO-d6): (3 = 7.83 (d, / NH 2 - 8.28 Hz,

1H, NH), 7.30-7.14 (m, 10H, aromat. H), 5.46 (s,

•^CH3, Lactyl

~

6 .8 8

Hz, 3H, M eLactyl); 1?C-NMR (DM SO-d6), /-m odu-

liertes Spinecho: d = 175.3(-) CCarboxyb 169.4(-)

137.0-125.0 Caromat, 100.3(+) C -l, 96.8(+)

CAmid,

1H,

H

a

c

e

t a i i s

c

h

) , 5.04 (d, J x2= 5.46 Hz, 1H, 1-H),

CAcetyi, 81.6(+) C-4,75.9(+) CLactyl, 75.1 C-3,69.0(-),

67.9(-). C-6, CBenzyb 62.9(+) C-5, 53.5(+) C-2 ,

22.6(+) CMe_Acetyl, 18.7(+) CMe-Lactyb FAB-MS, m /z

(rel. Int.): 472.4 (57) [M+H]+, 454.3 (7) [M+H-

H 20 ] +, 426.1 (7) [M +H-H CO O H ]+, 364.1 (100)

[M+H-Benzylalkohol]+.

4.64 (d, / OH3 = 3.08 Hz, 1H, O H ), 4.55 (d, / gem =

12.52 Hz, 1H, PhC/ZH’), 4.34 (d, / gem = 1252 Hz,

1H, P h C H //’), 3.98-3.35 (m, 6H, 2-H, 3-H, 4-H,

5-H, 6-H, 6’-H), 1.69 (s, 3H, C H 3); 13C-NMR

(DM SO-d6): (5 = 169.4 CAmid, 137.6, 128.7, 128.5,

127.9, 127.4, 127.0, 126.6, 126.3 Caromat, 100.8 C -l,

96.9 Cacetalisch, 82.0 C-5, 68.5, 67.9, 67.2 C-3, C-6

Cßenzyi, 62.8 C-4, 54.2 C-2, 22.5 CMe; FAB-MS, m /z

(rel. Int.): 799.7 (2) [2M+H]+, 400.3 (43) [M+H]+,

292.1 (14) [M+H-Benzylalkohol]+.

C25H 29N 0 8 (471.51)

Ber. C 63.69 H 6.16 N 2.97% ,

Gef. C 63.16 H 6.31 N 3.34% .

Allgem eine Vorschrift zur Festphasensynthese der

M uram yldipeptide

C22H 25N 0 6 (399.44)

Ber. C 66.17 H 6.27 N 3.51% ,

Gef. C 65.63 H 6.27 N 3.14% .

1 g Harz (3a, 3b, 3c oder 3d) werden mit 550 mg

(4.07 mmol) HOBt, 920 mg (4.47 mmol) DCC und

1.7 g (4.02 mmol) Fm oc-L-G lu(0/B u)-O H 3h lang

oder mit 180 mg (1.33 mmol) H O Bt, 360 mg

(1.75 mmol) DCC und 570 mg (1.34 mmol) Fmoc-

D-Glu(OfBu)-OH 5h bei R.T. gekuppelt. Nach

Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe mit 20-proz.

Benzyl-N -acetyl-2-am ino-2-desoxy-4,6-0-benzyli-

den-3-0-(D -l-carboxyethyl)-a-D -glucopy-ranosid

(6): Nach einem kom binierten Verfahren der in

den Zitaten [21,27] angegebenen Vorschriften

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762

H.-J. Kohlbau et al. • Festphasensynthese von Muramyldipeptiden an isomeren Trialkoxybenzylamin-Harzen

Piperidin in DM F (v/v) erfolgt die Umsetzung mit

1.25 g (4.02 mmol) Fmoc-L-Ala-OH oder Fmoc-

D -Ala-O H in Gegenwart von 550 mg (4.07 mmol)

H O B t und 920 mg (4.47 mmol) DCC innerhalb

von 3h bei R.T. Nach Entfernung der a-Amino-

schutzgruppe erfolgt die Kupplung mit 630 mg

C26H 38N4O n (582.61)

Ber. C 53.61 H 6.53 N 9.62%,

Gef. C 56.79 H 6.98 N 10.58%.

Benzyl-N-acetyl-m uram yl-L-alanyl-L-isoglutam in

(7b): Die Festphasensynthese wird am 2-Benz-

yloxy-4,6-dimethoxy-benzylamin-Harz (3a) durch-

geführt. Die Abspaltung des Produktes vom Harz

wird innerhalb von 2 h durchgeführt; Ausb. 260 mg

(60.4%), farbloses Lyophilisat, Schmp.: 141 °C;

[a]o° = +4.9° (c = 0.2 in Wasser); R = 0.72; 'H -

NM R (DM SO-d6): (5 = 8.11 (m, 2H, 2 x NH), 7.57

(d, J = 7.5 Hz, 1H, N H), 7.37-7.30 (m, 5H, aromat.

H), 7.09 (s, 2H, N H 2), 4.73 (d, J l 2 = 3.1 Hz, 1H,

1-H), 4.65 (d, 7gem = 12.5 Hz, 1FI, P h//H '), 4.46

(d, Jgem = 12.5 H z,lH , P h H //’), 4.32-4.12 (m, 3H,

(1.34 mmol)

Benzyl-Ar-acetyl-2-amino-2-desoxy-

4,6-0-benzyliden-3-0-(D -l-carboxyethyl)-a-D -

glucopyranosid (6) in Gegenwart von 180 mg

(1.33 mmol) H O Bt und 360 mg (1.75 mmol) DCC

an das Peptidharz. Nach jedem erfolgten Reak-

tionsschritt wird das Harz mit DM F/M eOH (1:1,

v/v), DM F und DCM jeweils dreimal gewaschen.

Die Abspaltung des M uramyldipeptids vom Harz

unter gleichzeitiger Entfernung perm anenter Sei-

tenkettenschutzgruppen der Aminosäuren erfolgt

mit 20 ml TFA/Thioanisol (95:5 v/v) innerhalb von

5 h. Nach beendeter Abspaltungsreaktion wird das

Harz abgetrennt und die Lösung im Vakuum bei

R.T. eingeengt. D er Rückstand wird in 3 ml H 20 /

A cOH (99:1 v/v) aufgenommen und das Rohpro-

dukt mit abs. E ther bei 0 °C ausgefällt. D er Nie-

derschlag wird abgesaugt und mit abs. E ther gewa-

schen. Nach HPLC-Trennung (Bedingungen:

Säule: SS 250 ^ “/lO Nucleosil® 7 C18; Eluenten:

A: 0.05% TFA/H 20 (v/v), B: TFA /H 20 /C H 3CN

0.05:60:40 (v/v); Gradient: 0 -5 min 95% A, 6 -

51 min linear 95-5% A; Flußrate: 2.5 ml/min; D e-

tektion bei X = 214 nm) und Lyophilisation der

Fraktionen erhält man die Reinprodukte.

HLactyl» H Ala, ^«-iGln), 3.80 (m, 1H, 2-H), 3.66 (m,

1H, 6-H), 3.55-3.48 (m, 2H, 4-H,6’-H), 3.45-3.25

(m,4H, 3-H, 5-H, 3-OH, 4-OH, H 20 ), 2.19 (t,

■^y-iGln. /3-iGln = 7.5 Hz, 2H, 7iGln‘CH 2), 1.93 (m, 1H,

ß iGln-CH H '), 1.79 (s, 3H, M eAcetyl), 1.75 (m, 1H,

i^iGln'CHH ), 1.25 (d, ^Me-Lactyl.Lactyl = 6.68 Hz, 3H,

MeLactyl), 1-22 (d, ^Me-Ala.Ala ~ 7.07 Hz, 3H,

MeAla); FAB-MS, m /z (rel. Int.): 605.3 (6)

[M+Na]+, 583.3 (35) [M+H]+, 475.2 (7) [M+H-

Benzylalkohol]+, 437.1 (5) [M +H-Isoglutamin]+,

289.7 (21) [M-H2]2+.

C26H38N4O n (582.61)

Ber. C 53.61 H 6.53

N 9.62%,

Gef. C 51.27 H 5.87 N 10.29%.

Benzyl-N-acetyl-m uram yl-L-alanyl-D-isoglut-

amin (7a): Die Festphasensynthese wird mit dem

2-Benzyloxy-4,6-dimethoxy-benzylamin-Harz (3a)

durchgeführt. Die A bspaltungsdauer des Produk-

tes vom Harz beträgt 1.5 h; Ausb. 250 mg (53.3%),

farbloses Lyophilisat, Schmp.: 152 °C; [a]o° =

Benzyl-N-acetyl-m iiram yl-D-alanyl-L-isoglutam in

(7c): Für die Festphasensynthese wird das 4-Benz-

yloxy-2,6-dimethoxy-3-methylamin-benzylamin-

Harz (3d) verwendet. Die A bspaltungsdauer des

Produktes vom Harz beträgt 3.5 h; Ausb. 180 mg

(52.4%), farbloses Lyophilisat, Schmp.: 138 °C;

+22.2° (c = 0.2 in Wasser),

= 0.74; 1H-NM R

(DM SO-d6): ö = 8.32 (d, J = 7.00 Hz, 1H, NH),

7.93-7.89 (m, 2H, 2 x NH), 7.23-6.93 (m, 7H. aro-

mat. H, N H 2), 4.50 (d, / gem = 12.3 Hz, 1H, P h //H ’),

4.43 (d, Jh2 = 3.5 Hz, 1H, 1-H), 4.26 (d, / gem =12.3

Hz 1H, PhH / / ’), 4.02 (q, / Lactyl,M e-Lactyl = 7.00 Hz,

1H, H Lactyl), 3.96-3.92 (m, 2H, H Ala, H a.ioln), 3.75

(m, 1H, 2-H), 3.48 (d, J6& = 10.7 Hz, 1H, 6-H),

3.36 (d, J6-6 = 10.7 Hz, 1H, 6’-H), 3.34-3.21 (m,

3-H, 4-H, 5-H, 3-OH, 4-OH, H zO), 2.00 (t, /y„iGln

ß-iGin = 7.7 Hz, 2H, yiGln-CH2), 1.82 (m, 1H, ß iGln-

CH H '), 1.66 (s, 3H, M eAcetyl), 1.48 (m, 1H, ß Gln-

[a]o0 +29.7° (c - 0.2 in Wasser);

= 0.75; ’H-

NM R (DM SO-d6): (3 = 8.68 (d, / = 6.8 Hz, 1H,

NH), 8.28-8.24 (m, 2H, 2 x NH), 7.59-7.22 (m,

7H, aromat. H, N H 2), 4.91 (d, Jx2 = 3.4 Hz, 1H, 1-

H), 4.84 (d, 7gem= 12.45 Hz, 1H, P h //H ’), 4.61 (d,

7gem = 12.45 Hz 1H, P h H //’), 4.46-4.32 (m, 3H,

H Lacty., H Ala, H a.iGln), 4.04 (m, 1H, 2-H), 3.98 (d,

y66 = 10.5 Hz, 1H, 6-H), 3.84 (d, / 66- = 10.5 Hz

1H, 6’-H), 3.75-3.46 (m, 3-H, 4-H, 5-H, 3-OH, 4-

OH, H 20 ), 2.37 (t, Jy.\G\n.ß-\G\n= 7.8 Hz, 2H, yiGln-

CH 2), 2.13 (m, 1H, ß iGln-CH H '), 1.96 (s, 3H,

M eAcetyl), 1.87 (m, 1H, ß iCln-C H H ), 1.42 (d,

CH / / ), 1.06 (d, JMe-Lactyl.Lactyl = 7.00 Hz, 3H,

M eLactyl), 0.99 (d, 7Me-Aia.Aia

= 6.90 Hz, 3H,

MeAla); FAB-MS, m /z (rel. Int.): 583.61 (58)

[M+H]+, 475.0 (16) [M+H-Benzylalkohol]+, 437.0

(12) [M+H-Isoglutamin]+, 329.2 (34) [M+H-Benz-

ylalkohol-Isoglutamin]+, 289.0 (62) [M-H2]2+.

^Me-Lactyl.Lactyl — 6.7 Hz, 3H, MeLactyl)» 1-39 (d,

JMe-Aia Ala = 7.0 Hz, 3H, M eAla); FÄB-MS, m /z

(rel. Int.): 583.2 (60) [M +H]+, 475.0 (7) [M+H-

Benzylalkohol]+, 437.0 (12) [M +H-Isoglutamin]+.

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H.-J. Kohlbau et al. • Festphasensynthese von Muramyldipeptiden an isomeren Trialkoxybenzylamin-Harzen

763

C26H 38N 4 0 n (582.61)

Ber. C 53.61 H 6.53 N 9.62% ,

N -Acetyl-m uram yl-L-alanyl-D-isoglutam in (8a):

230 mg (0.40 mmol) Benzyl-N-acetyl-muramyl-L-

alanyl-D-isoglutamin (7a) werden hydriert; Ausb.

170 mg (87.4%), farbloses Lyophilisat, Schmp.:

192 °C (Lit. [28] 190-194 °C); [a]£° = +30.8° (c =

0.2 in Wasser) {Lit. [29] +33° (c = 0.5 in Wasser)};

0.25; 'H -N M R (D90): <3 = 5.17 (d, J 12 = 3.4

Hz, 1H, 1-H), 4.40-4.27 (m, 2H, H Lactyl,Ha.iGln),

4.23 (q, / A ia,M e-A.a = 6.72 Hz, 1H, H Ala), 4.00-3.49

(m, 6H, 2-H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 6’-H), 2.48 (t,

•^y-iGln, /3-iGln = 7 .2 Hz, 2H, 7iGin-CH2), 2.22 (m,

1H, ß iGln-CH H '), 1.99 (s, 3H, M eAcetyl), 1.97 (m,

1H, /3jGin-CHH ), 1.08 (^M e-Lactyl, Lactyl = ^.20 Hz,

3H, M eLactyl), 1.03 (d, ^Me-Aia.Aia = 6.72 Hz, 3H,

MeAla); FAB-MS; m /z (rel. Int.): 514.9 (8)

[M+Na]+, 493.0 (61) [M+H]+, 475.0 (29) [M+H-

H20 ]+, 347.1 (21) [M +H-Isoglutamin]+.

Gef. C 50.98 H 5.88 N 9.23% .

Benzyl-N-acetyl-m uram yl-D-alanyl-D-isoglutam in

(?d): Zur Festphasensynthese wird das 4-Benz-

yloxy-2,6-dimethoxy-benzylamin-Harz (3b) einge-

setzt. Die Abspaltung des Produktes vom Harz er-

folgt in 5 h; Ausb. 160 mg (43.6%), farbloses Lyo-

philisat, Schmp.: 157 °C; [a]o° = +34.3° (c = 0.2 in

Wasser); Ff}= 0.74; 'H -N M R (DM SO-d6): ö = 8.13

(d, J = 7.00 Hz, 1H, NH), 7.81 (d, J = 8.00 Hz, 1H,

NH), 7.60 (d, / = 7.3 Hz, 1H, NH), 7.17-6.88 (m,

7H, aromat. H, N H 2), 4.66 (d, J x2 = 3.3 Hz, 1H, 1-

H), 4.47 (d, / gem. = 12.5 Hz, 1H, P h //H ’), 4.29 (q,

6.88 Hz, 1H, H Lactyl), 4.24 (d,

•A.actyl.Me-Lactyl

—

7gem = 12.5 Hz 1H, P h H //’), 4.17-4.00 (m, 2H,

H Ala,Ha.lGln), 3.50 (m, 1H, 2-H), 3.45 (d, / 6,6- =

10.3 Hz, 1H, 6-H), 3.35-3.13 (m, 3-H, 4-H, 5-H,

6’-H, 3-OH, 4-OH, H 20 ), 2.03 (t, Jy.iGln, ß ,lGln =

6.74 Hz, 2H,yiGln-CH2), 1.74 (m, lH ,ß iGln-C //H '),

1.64 (s, 3H,M eAcetyl), 1.58 (m, 1H, ß iGln-C H //’),

1.07 (d, -/M e-Lactyl,Lactyl — 6.88 Hz, 3H, MeLactyi),

1.05 (d, JM e-Ala,A la = 7.12 Hz, 3H, M eA]a); FAB-

MS, m /z (rel. Int.): 621.1 (7) [M+K]+, 605.2 (15)

[M+Na]+, 583.2 (44) [M+H]+, 475.2 (20) [M+H-

Benzylalkohol]+, 437.1 (19) [M +H-Isoglutamin]+.

C 19H32N 40n (492.48)

Ber. C 46.34 H 6.50 N 11.38%,

Gef. C 49.46 H 6.98 N 11.88%.

N -Acetyl-m uram yl-L-alanyl-L-isoglutam in

(8b):

220 mg (0.38 mmol) Benzyl-Af-acetyl-muramyl-L-

alanyl-L-isoglutamin (7b) werden hydriert; Ausb.

155 mg (83.3%), farbloses Lyophilisat, Schmp.:

186 °C; [a]o°= +19.4° (c = 0.2 in Wasser) (Lit.

[30] +16° (c = 0.5 in Wasser); ^ = 0.23; 1H-

NM R (D20 ): (3 = 5.16 (d, J x2 = 3.5 Hz, 1H, 1-

H), 4.36-4.22 (m, 3H, H Lactyl, H Ala HiGin), 3.97

(dd, J23 = 10.4 Hz J2l = 3.5 Hz, 1H, 2-H), 3.93-

3.48 (m, 5H, 3-H 4-H 5-H 6-H 6’-H), 2.47 (td,

C26H 38N 40n (582.61)

Ber. C 53.61 H 6.53 N 9.62%,

Gef. C 53.40 H 6.89 N 9.58%.

•^y-iGln, /3-iGln — 7.38 Hz, ./y-iGln, a-iGln — 2.70 Hz,

2H, ylGln-CH2), 2.14 (m, 1H, ß iGln-CH H '), 1.99

(m, 1H, Acm-CHH % 1.98 (s, 3H, M eAcetyl), 1.42

Allgem eine Vorschrift zur Hydrierung der

Benzyl-N -acetyl-m uram yldipeptide

(d, ^M e-Lactyl,Lactyl — 7.30 Hz, 3H, MeLactyi), 1.39

(d, ^Me-AiaAia = 6.80 Hz, 3H, M eAla); FAB-MS,

m /z (rel. Int.): 531.0 (99) [M+K]+, 515.0 (74)

[M+Na]+, 493.0 (52) [M+H]+, 475.0 (36) [M+H-

H 20 ] +, 329.0 (75) [M +H-H20-Isoglutam in]+.

Die isolierten Benzyl-iV-acetyl-muramyldipep-

tide 7a-d werden jeweils in 5 ml M ethanol/AcOH

(99:1, v/v) gelöst. Es wird eine Spatelspitze Palla-

dium auf Aktivkohle (10-proz.) als Katalysator

hinzugegeben und dann in einer H ydrierapparatur

jeweils 18 h lang hydriert. Nach Abfiltration des

Katalysators über Celite wird die Lösung unter

Vakuum eingeengt und der Rückstand in Wasser

aufgenommen und lyophilisiert. Die Reinheits-

kontrolle der isolierten N-Acetyl-muramyldipep-

tid-Isomeren 8a-d erfolgt durch HPLC. Wie die

HPLC-Untersuchungen zeigen, fallen die Mura-

C i Ä ^ O n (492.48)

Ber. C 46.34 H 6.50 N 11.38%,

Gef. C 46.68 H 6.71 N 11.43%.

N -Acetyl-m uram yl-D-alanyl-L-isoglutam in

(8c):

150 mg (0.26 mmol) Benzyl-N-acetyl-muramyl-D-

alanyl-L-isoglutamin (7c) werden hydriert; Ausb.

myldipeptidderivate in hoher Reinheite an (C hro- 105 mg (82.8%), farbloses Lyophilisat, Schmp.:

matographische Bedingungen: Säule: LiChro-

spher® RP-18 5 //m; Eluenten: A: 0.05% TFA in

H 20 ( V /V ) , B: TFA/H20 /C H 3CN 0.05:40:60 (v/v);

Gradient: 0 -1 min 95% A, 1-31 min linear 9 5 -

5% A; Flußrate 1 ml min; D etektion bei A =

214 nm).

188 °C; [«B°= +40.6°

(c = 0.2 in Wasser) [Lit. [31]

+51° (c = 0.5 in Essigsäure)]; 7 ^= 0.25; 'H -N M R

(DoO): ö = 5.26 (d, Jx2 = 3.4 Hz, 1H, 1-H), 4.43-

4.31 (m, 3H, H Lactyl, H Ala, H iGln), 4.05 (dd, J23 =

10.3 Hz, J2 j = 3.4 Hz, 1H, 2-H), 3.91 (m, 2H, 6-H,

6’-H), 3.79'(dd, J43 = 10.1 Hz, J45 = 10.1 Hz, 1H,

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764

H.-J. Kohlbau et al. • Festphasensynthese von M uramyldipeptiden an isomeren Trialkoxybenzylamin-Harzen

4-H), 3.66 (dd, 732 = 10.3 Hz, J34 = 10.3 Hz, 1H.

3-H), 3.56 (m, 1H. 5-H), 2.52 (t, 7y_iGln ß .iCht = 7.4 4.15 (m, 2H, H Ala, H a.ioln), 3.81 (dd, 723 = 10.4

(q? 7 L acty|.M e-Lactyl —6.93 Hz, 1H, HLacty|), 4.26

Hz, 2H, yiGln-CH2), 2.21 (m. 1H, ß iGln-CH U '), 2.09

(m, 1H, ß Gln-CH H % 2.07 (s, 3H. MeAcetyl), 1.54

(d. 7M e-Lactyl,Lactyl = "7.2 Hz, 3H, MeLactyl)’ 1-47 (d,

^Me-AiaAia = 6.8 Hz, 3H, M eA)a); LD-MS, m /z (rel.

Int.): 532 (26) [M+K]+, 515 (33) [M+Na]+.

Hz, 7 ,, = 3.48 Hz, 1H, 2-H), 3.78-3.37 (m, 5H, 3-

H. 4-H. 5-H. 6-H, 6*-H), 2.39 (t, 7HGIn ß,iGln = 6.6

Hz, yiG,n-CH2), 2.05 (m, 1H, ß oln-C/*H ’), 1.91 (s,

3H, M eAcetyl), 1.90 (m, 1H, ß~ iGln-C H H % 1.30 (d,

7M e-Lactyl.Lactyl = 6.93 Hz, 3H, M eLacty|), 1.27 (d,

7Me-AiaAia = 6.58 Hz, 3H, M eAla); FÄB-MS, m /z

(rel. Int.): 531.0 (8) [M+K]+, 516.1 (16) [M+Na]+,

493.1 (65) [M+H]+, 475.2 (32) [M +H-H20 ] +, 347.1

(12) [M+H-Isoglutamin]*.

C 19H 32N4O n (492.48)

Ber. C 46.34 H 6.50 N 11.38%,

Gef. C 44.92 H 6.23 N 10.83%.

C19H 32N40 11 (492.48)

Ber. C 46.34 H 6.50 N 11.38%,

Gef. C 46.26 H 6.94 N 11.94%.

N-Acetyl-m iiram yl-D-alanyl-D-isoglutam in

(8d)

140 mg (0.24 mmol) Benzyl-yV-acetyl-muramyl-D-

alanyl-D-isoglutamin (7d) werden hydriert; Ausb.

90 mg (76.0%), farbloses Lyophilisat, Schmp.:

197 °C; [a]o°= +57.30° (c = 0.2 in Wasser) {Lit. [31]

+68° (c = 0.5 in Essigsäure)}; /§ = 0.21; 'H -NM R

(DoO): d = 5.10 (d, 7, 2 = 3.48 Hz, 1H. 1-H), 4.29

Dank

Wir danken dem Deutschen Akademischen

Austauschdienst für die finanzielle Unterstützung

dieser Arbeit.

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Solid phase synthesis of muramyl dipeptides on isomeric trialkoxybenzylamine resins

DOI: 10.1515/znb-1998-0716

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