Neuraminic acids in plants? The 2-keto-3-desoxyaldonic acids in plants and synthesis of 3-desoxy-D-glycero-beta-D-galacto-nonulosonic acid

Full text of DOI:10.1515/znb-1968-1206

Neuraminsäure in Pflanzen?
Die 2-Keto-3-desoxyaldonsäuren in Pflanzen und die Synthese der
3-Desoxy-D-glycero-ß-D-galakto-nonulosonsäure
W . G ie l e n
Max-Planck-Institut für Hirnforschung, Abteilung Tumorforschung und experimentelle Pathologie,
Köln-Lindenthal (Direktor: Prof. Dr. W. T ö n n is) und Pharmakologisches Institut
der Universität Köln (Direktor: Prof. Dr. H. F. Z ip f)
(Z. Naturforschg. 23 b, 1598— 1601 [1968] ; eingegangen am 15. Juni 1968)
Die ausschließliche Charakterisierung von Neuraminsäure mittels der Perjodat-Thiobarbitur-
säure-Reaktion ist nicht ausreichend. Diese Reaktion erfaßt alle Verbindungen vom Typ der 2-Keto-
3-desoxyaldonsäuren. Die aus Sojabohnen und Bananen isolierten Substanzen gehören zur Gruppe
dieser stickstofffreien 2-Keto-3-desoxyaldonsäuren. Sie zeigen eine positive Perjodat-Thiobarbitur-
säure-Reaktion, reagieren aber nicht mit B i a 1s Reagenz.
Die Neuraminsäure ist eine weitverbreitete, ter-
minale Strukturkomponente in Glykoproteiden, Gly-
kolipoiden und Oligosacchariden des tierischen Or-
ganismus. Sie wird als Bestandteil von Polysaccha-
riden auch in Mikroorganismen angetroffen1. Der
Verbindung kommt die Struktur einer 5-Amino-3.5-
didesoxy-nonulosonsäure zu, die in V-Substitution
eine Acetyl- oder eine Glykolylgruppe trägt. Sie ist
ein Kondensationsprodukt des /V-Acylmannosamins
und der Brenztraubensäure. Aus diesen Bausteinen
wird sie biosynthetisiert2, aus diesen Bausteinen
kann sie in vitro kondensiert werden 3.
eindeutiger zu klassifizieren, haben wir Sojabohnen-
und Bananenhydrolysate untersucht. Die Sojabohne
enthält nach Angabe obengenannter Autoren4 40
mg-%, die Banane nur 8,04 mg-% Neuraminsäure 5.
Bei der Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials
modifizierten wir die angegebene Methodik 4 in fol-
gender Weise:
300 g Sojabohnen wurden mit 70-proz. Äthanol,
das 0,3% Quecksilber-II-chlorid enthielt, gründlich
gewaschen, 12 Stdn. bei Raumtemperatur in Was-
ser aufbewahrt und anschließend in 3 l Aceton
homogenisiert. Den lufttrockenen Rüdestand extra-
hierten wir zweimal mit je 800 ml Benzol in der
Siedehitze. Der fettfreie Rüdestand wurde an der
Luft getrocknet, anschließend in 800 ml 0,1-n.
H2S04 suspendiert und unter Rühren eine Stde. lang
bei 80 C hydrolysiert. Wir neutralisierten die Sus-
pension mit gesättigter Ba(OH) 2-Lösung und dialy-
sierten sie gegen dest. Wasser bei 4 °C. Die Außen-
flüssigkeit wurde gesammelt und im Vakuum-Rota-
tionsverdampfer auf ein kleines Volumen einge-
dampft. Die konzentrierte Lösung fraktionierten wir
an einer Anionen-Austauschersäule Lewatit MIH
(Formiatform). Das H20-Eluat war frei von Sub-
stanzen mit positiver Perjodat-Thiobarbitursäure-
Reaktion. Mit 0,5-n. HCOOH wurde die Haupt-
Uber das Vorkommen der Neuraminsäure in
pflanzlichem Material ist mehrmals berichtet wor-
den. Mayer, DaM und Pazur 4 fanden die V-Glyko-
lylneuraminsäure in den Extrakten bzw. Hydrolysa-
ten der Sojabohne (Glycine max) und des alfalfa
(Medicago sativa). OnODera, HiranO und HayasHi 5
konnten die Neuraminsäure in zahlreichen Pflanzen-
extrakten nachweisen. Der Gehalt an Neuraminsäure
variierte von wenigen mg-% bis maximal 66 mg-
Prozent. Zur Charakterisierung der Neuraminsäure
diente den Autoren vornehmlich die Perjodat-Thio-
barbitursäure-Reaktion nach W arren 6, nicht näher
bezeichnete Proben wurden zusätzlich mit p-Dime-
thylaminobenzaldehyd ( E h r l i c h Reagenz) und
Orcin bzw. Resorcin (B i a 1s Reagenz) geprüft.
Um die aus Pflanzen stammenden und mit Per-
jodat-Thiobarbitursäure reagierenden Verbindungen
menge
der
Perjodat-Thiobarbitursäure-positiven
Verbindung desorbiert. Mit 1-n. HCOOH und 2-n.
HCOOH wurde die Elution vervollständigt.
4 F. C. M a y e r , R. Dam u. J. H . P a zu r, Arch, biochem. Bio-
physics 108, 356 [1964].
5 K. O n o d e ra , S. H ira n o u. H . H a ya sh i, Agric. biol. Chem.
30, 1170 [1966].
1 G . T. B a r r y , J. exp. Medicine 107, 507 [1958] ; E. J.
M c G u ire u. S. B . B in k le y , Biochemistry 3, 247 [1963].
2 S. Rosem an, G . W . Jourdian, D. W atso n u. R . R ood, Proc.
nat. Acad. Sei. USA 47, 958 [1961].
6 L. W a r r e n , J. biol. Chemistry 234, 1971 [1959] ; D . Am i-
n o ff, Biochem. J. 81,384 [1961].
3 J. W . C o rn fo rth , M. E. F irth u. A. G o ttsch alk , Biochem.
J. 68,57 [1958].
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500 g ungeschälte reife Bananen wurden in 3 1
Aus dem konzentrierten Eluat des Bananen-
Aceton homogenisiert. Der Rückstand wurde noch extraktes kristallisierte Bernsteinsäure aus (Schmp.
zweimal mit frischem Aceton verrührt. Das Aceton- 183- 184 °C ).
trockenpulver hydrolysierten wir in der oben be-
schriebenen Weise. Der Neutralisation mit gesättig-
ter Ba(OH) 2-Lösung und der Dialyse folgte wieder
die Fraktionierung an Lewatit MIH (Formiatform).
Die gesamten mit Perjodat-Thiobarbitursäure reagie-
renden Verbindungen konnten mit 0,5-n. HCOOH
von der Säule eluiert werden.
Aus dem sirupösen Rückstand konnten keine ein-
heitlichen, mit Perjodat-Thiobarbitursäure reagie-
renden Verbindungen herauskristallisiert werden
(Abb. 1).
Bei den mit Perjodat-Thiobarbitursäure nachge-
wiesenen Substanzen dürfte es sich um 2-Keto-3-
desoxyaldonsäuren handeln, die teils frei teils phos-
phoryliert vorliegen. Säuren dieses Typs sind in der
Natur weitverbreitet. In einem zusammenfassenden
Beitrag hat G ottschalk 7 die strukturellen Be-
ziehungen der 2-Keto-3-desoxyaldonsäuren mit 5, 6,
7 und 8 C-Atomen aufgezeigt und auf die enge Ver-
wandtschaft zur Neuraminsäure hingewiesen. Die
2-Keto-3-desoxy-6-phosho-gluconsäure wurde aus
zahlreichen Mikroorganismen isoliert8, die 3-Des-
oxy-D-arabo-7-phospho-heptulosonsäure ist, sowohl
in Mikroorganismen9 als auch in höheren Pflan-
zen 10, als erste Zwischenstufe der Biosynthese aro-
matischer Aminosäuren erkannt worden, sie wird
aus Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolbrenz-
traubensäure aufgebaut. Eine Synthetase aus Pseudo-
monas aeruginosa schließlich katalysiert die Reak-
tion von Arabinose-5-phosphat und Phosphoenol-
brenztraubensäure zu 3-Desoxy-D-manno-8-phospho-
Sowohl bei der Sojabohne als auch bei der Ba-
nane enthielten alle Eluate, die eine positive
Perjodat-Thiobarbitursäure-Reaktion zeigten, auch
Phosphor. In keiner Fraktion konnte mit B i a l s
Reagenz der für Neuraminsäure charakteristische
rotviolette Farbstoff entwickelt werden.
Elutionsmittel
0,5-n.
1-n.
2-n.
HCOOH
HCOOH HCOOH
Fraktionen
je 5 ml
4-100 101-150 151-245 246-450
Sojabohne:
Phosphor-
gehalt* [% ]
0,14
0,21
0,70
0,13
0,60
-
1,05
-
Banane: Phosphor-
gehalt* [% ]
* Bezogen auf den Trockenrückstand der vereinigten Frak-
tionen. Tab. 1. Verlauf der Elution.
Front
Abb. 1. Dünnschichtchromatogramm der Pflan-
zenhydrolysate auf Cellulose (Macherey und
Nagel, MN 300), Laufmittel: n-Butanol/Eis-
essig/H20 (52:14:39), nach Vorbehandlung
der Celluloseplatten mit l-/i. HCl. Anfärbung:
Thiobarbitursäure nach vorheriger Perjodat-
oxydation8.
Start
I
II
III
IV
V
I. Testsubstanzen: N-Acetyl- und 7V-Glykolylneuraminsäure,
II. Hydrolysat aus Bananen: 1. Eluat mit 0,5-re. HCOOH,
III. Hydrolysat aus Bananen: 2. Eluat mit 0,5-n. HCOOH,
IV. Hydrolysat aus Sojabohnen: Eluat mit 0,5-n. HCOOH,
V. Hydrolysat aus Sojabohnen: Eluat mit 2,0-n. HCOOH.
7 A. G o tts c h a lk , Rev. pure applied Chem. 12, 46 [1962].
8 J. M c G e e u. M . D o u d o r o ff, J. biol. Chemistry 210, 617
9 P. R. S rin iva sa n , M . K a t a g ir i u. D . B. S p rin son , J. biol.
Chemistry 234, 713 [1959].
[1954] ; R. K o v a c h e v ic h u.
213, 757 [1955].
W
.
W o o d , J. biol. Chemistry 10 T. M in am ik aw a, Plant and Cell Physiol. 8, 695 [1967].
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octulosonsäure u . Eine 3-Desoxy-D-manno-octuloson-
säure wurde kürzlich auch in der Lipopolysaccharid-
fraktion von Pasteurella aufgefunden 12.
Das Syntheseprodukt war in seinen Eigenschaften
(IR-Spektrum, Ä/-Wert, Schmelzpunkt, Drehwert)
identisch mit einem Vergleichspräparat, das wir aus
V-Acetylneuraminsäure in 60-proz. Ausbeute nach
folgendem Schema erhielten:
Die entsprechende stickstofffreie Säure mit 9 C-
Atomen ist unseres Wissens bisher nicht beschrie-
ben worden. Wir haben diese 3-Desoxy-nonuloson-
säure in Anlehnung an die von Kuhn und Baschang 13
für 7V-Acetylneuraminsäure ausgearbeitete Methode
aus D-Mannose und dem Kaliumsalz des Oxalessig-
säure-di-tert.-butylesters dargestellt. Nach Aufarbei-
tung des Reaktionsansatzes wie bei der Synthese der
V-Carbobenzoxyneuraminsäure14 beschrieben, kri-
stallisiert die Verbindung aus Eisessig/H20 (1:1)
in langen Nadeln vom Schmelzpunkt 148 °C (Aus-
beute: 15 —18% bez. auf D-Mannose).
/V-Acetylneuraminsäure —> Methylestermethylgly-
kosid der Neuraminsäure (mit freier Aminogruppe)
—>■ Desaminierung mit NaN02 bei pH 3 —4 —> Ent-
ionisierung der Lösung mit Anionen- und Kationen-
austauschern —> Verseifung im alkalischen und Ent-
glykosidierung im aciden Milieu.
1 g /V-Acetylneuraminsäure wurden in 50 ml
5-proz. methanolischer HCl 6 Stdn. unter Rückfluß
und Feuchtigkeitsausschluß gekocht. Nach dem Er-
kalten neutralisierten wir die Lösung mit Anionen-
austauscher Dowex-1 (HC03e-form), filtrierten und
dampften sie zum Sirup ein. Das Methylestermethyl-
glykosid der Neuraminsäure ist chromatographisch
einheitlich, es kann mit Ninhydrin auf der Dünn-
schichtplatte sichtbar gemacht werden. Den obigen
Sirup lösten wir in 100 ml Wasser, die Lösung
wurde mit 1-n. Essigsäure auf pH 3,5 eingestellt.
Unter Rühren ließen wir eine Lösung von 300 mg
NaN02in 10 ml Wasser eintropfen. Nach 30 Min. war
die N2-Entwicklung praktisch beendet. Das Reak-
tionsgemisch filtrierten wir zur Entfernung der
Ionen über eine Austauschersäule, deren untere
Hälfte mit Lewatit MIH (OH0-form) und deren
obere Hälfte mit Dowex-50 (H®-form) gefüllt war.
in Wasser).
2,05
=
D
-4 5 ,2 ° (c
=
l>]
C9H160 9 (268,2)
C
H
COOH
1
1
40,30 6,01
40,21 6,04
Berechnet:
Gefunden:
c = o
1
1
(Synthese-
produkt)
c h 2
40,15
(Vergleichs-
präparat aus
/V-Acetyl-
neuramin-
säure)
6,13
(CHOHh
1
c h 2o h
In analoger Reaktion sind auch die homologen
Verbindungen mit kürzerer Kohlenstoffkette leicht
zugänglich.
Abb. 2. Dünnschichtdiromatogramm der
3-Desoxynonulosonsäuren auf Cellulose.
Laufmittel:
n-Butanol/n-Propanol/0,l-ra.
Front
Start
HCl (1:2:1), nach Vorbehandlung der
Celluloseplatte mit 1-n. HCl. Anfärbung:
Thiobarbitursäure nach vorheriger Per-
jodatoxydation 6. I. Test N-Acetylneuramin-
säure, II. 3-Desoxy-nonulosonsäure (Syn-
theseprodukt) , III. 3-Desoxy-nonuloson-
säure (Vergleichspräparat aus N -Acetyl-
neuraminsäure), IV. Test N-Acetyl- und
iV-Glykolylneuraminsäure.
11 D . H . Levin u. E. R ack er, J. biol. Chemistry 234, 2532
[1959].
12 D . C. E llw o o d , Biochem. J. 106, 47 P [1968].
13 R . K uhn u. E. Baschang, Liebigs An. Chem. 659, 156
[1962].
14 W. G ie le n , Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 348, 329
[1967].
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men
4 bis 8 mit derjenigen der Neuraminsäure
Das Filtrat wurde zum Sirup eingedampft. Das Me-
thylestermethylglykosid der 3-Desoxy-nonuloson-
säure reagiert nicht mit B i a 1s Reagenz. Zur Ver-
seifung lösten wir den Sirup in 50 ml Wasser. Die
Lösung wurde mit 0,1-n. NaOH auf pH 10 einge-
stellt und unter Rühren bei Raumtemperatur durch
stete Zugabe von 0,1-n. NaOH auf diesem pH gehal-
ten. Anschließend wurde die Lösung zwecks Elimi-
nierung der Na®-Ionen über eine Kationenaustau-
schersäule Dowex-50 (H®-form) filtriert. Das auf
50 ml konzentrierte, wäßrige Eluat wurde bei Gegen-
wart von 5 g Dowex-50 (H®-form) in 2 Stdn. bei
100 °C zur 3-Desoxynonulosonsäure entglykosi-
diert. Der Filtration, Klärung mit Tierkohle und
erneuter Filtration schloß sich eine Gerfiertrocknung
an. Das gefriergetrocknete Material kristallisierte
aus Eissesig/H20 (1:1) in langen Nadeln.
übereinstimmt, daß die 3-Desoxy-D-glycero-/?-D-ga-
lakto-nonulosonsäure tatsächlich vorliegt. Weder das
Syntheseprodukt noch das aus TV-Acetylneuramin-
säure dargestellte Vergleichspräparat bilden mit
B i a 1s Reagenz den für Neuraminsäure charakteri-
stischen rotvioletten Farbstoff. Für die Chromogen-
bildung ist offenbar die Aminogruppe am C-Atom 5
eine notwendige Voraussetzung. Die „freie“ Neur-
aminsäure bzw. ihre innere Schiffsche Base, die
4-Hydroxy -5 -[1.2.3.4-tetrahydroxybutyl] -zl1-pyrro-
lin-carbonsäure 13, zeigen eine positive B i a 1-Reak-
tion, ebenso das nach Perjodatoxydation und nach-
folgender NaBH4-Reduktion aus ketosidisch-gebun-
dener V-Acetylneuraminsäure erhältliche C7-Homo-
loge.
Alle 2-Keto-3-desoxyaldonsäuren reagieren nach
Perjodatoxydation mit Thiobarbitursäure unter
Ausbildung eines intensiven, roten Farbstoffes. Aus
ihnen entsteht nach Perjodatoxydation die /?-Formyl-
brenztraubensäure, das Chromogen der Thiobarbi-
tursäure-Reaktion16. Dieselbe Reaktion vollzieht
sich an der Neuraminsäure bzw. an der /V-Acetyl-
neuraminsäure nach Verlust der Acetylgruppe. Nach
Reduktion der 2-Ketogruppe mit NaBH4 geht die
positive Perjodat-Thiobarbitursäure-Reaktion ver-
loren 16.
Ausbeute: 0,52 g (60% d. Th. bez. auf 7V-Acetyl-
neuraminsäure. Schmp.: 148 °C, [a] ff = —47,0°
(c = 0,9 in Wasser).
Die Desaminierung der Methoxyneuraminsäure
nach van S 1y k e hat k lenk bereits 1941 durch-
geführt, ohne das Desaminierungsprodukt zu isolie-
ren. Er hatte so bewiesen, daß in der Methoxy-
neuraminsäure der gesamte Stickstoff als Amino-
stickstoff vorliegt15.
Wir dürfen annehmen, daß am Syntheseprodukt
die Konfiguration der Substituenten an den C-Ato-
15 E. K le n k , Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 268. 50 [1 9 4 1 ].
16 A. W eissb a ch u. J. H u r w itz , J. b io l. Chemistry 234, 705
[1 9 5 9 ].
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