SYNTHESE VON GLUCOSE-3.4-14C HOHER SPEZIFISCHER AKTIVITÄT
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(etwa 25 Einheiten) Ribulosediphosphat-Carboxylase,
Fructose-3.4-l4C
nach R a c k e r 8 aus Spinat isoliert. In dem einen Schen-
kel der Doppelansatzbirne befanden sich je 0,2 ml
halbkonzentrierte HCl, im anderen 3,5 mg (18 //Mole)
Ba14C03 (0,7 mC). Nach Temperaturausgleich wurde
die Säure in der Ansatzbirne zum Ba14C03 gekippt. Die
Aufnahme des entstehenden 14C02 wurde manometrisch
verfolgt. Nach 30 min war die Hauptmenge absorbiert.
In jedes Gefäß wurde nun unter möglichst kurzzeitigem
Offnen eine auf p h = 8 gebrachte Lösung von 1 8 //Mo-
len Ribulose-diphosphat (dargestellt nach H o r e c k e r 9)
in 1,5 ml einpipettiert. Nach einer Reaktionszeit von
3 Stdn. wurde die BaCl2-haltige Salzsäure aus der Dop-
pelansatzbirne zum Unterbrechen der Reaktion einge-
kippt. Das ausgetriebene, nicht umgesetzte 14C02 wurde
manometrisch gemessen (etwa 50% des eingesetzten).
Es wurde durch einen N2-Strom in eine Falle mit NaOH
iibergeführt.
Die Zonen mit der hauptsächlichen Radioaktivität
(ca. 90%), die dem Rf-Wert und einem enzymatischen
Test nach (neben Phosphoglycerinsäure und Triose-
phosphat) das Fructose-diphosphat enthielten, wurden
eluiert und zur Trockene lyophisiliert. Der Rückstand
wurde in Wasser aufgenommen, mit 50 //Molen MgCl2
und 0,2 ml 10-proz. Essigsäure versetzt und mit Me-
thylrot als Indikator auf ph 5,5 eingestellt. Die Lösung
(5 ml) wurde mit 0,5 ml einer Polidaselösung (saure
Phosphatase) versetzt, die folgendermaßen erhalten
wurde: 1 g des handelsüblichen Polidase-Trockenpul-
vers wurde in 100 ml Wasser gelöst und bei 0° mit
Ammonsulfat gefällt. Die Fraktion von 0,75 bis 1,0
Sättigung wurde in 3 ml Wasser gelöst. 1 ml dieser
Lösung setzte in einem analogen Ansatz (5 •10~3-m. an
Fructose-diphosphat) in der Stde. etwa 20 //Mole
Orthophosphat frei.
Der Inhalt der beiden W a r b u r g - Gefäße wurde
nach Behandlung mit Dowex 50 (H®-Form) papier-
chromatographisch aufgearbeitet (n-Butanol —Essig-
säure—Wasser 50 : 14 : 35). Eine enzymatische Ge-
haltsbestimmung ergab in den Eluaten der Papier-
chromatogramme 40 //Mole 3-Phosphoglycerinsäure,
entsprechend einer Ausbeute von 55% (bezogen auf ein-
gesetztes Ribulose-diphosphat). Zur Reinigung wurde
das Eluat mit Dowex 50 (H®-Form) und Norit A be-
handelt und dann bis zur Trockene lyophilisiert. Der
Rückstand wurde wie folgt weiterverarbeitet.
Die Lösung der radioaktiven Zuckerphosphate wurde
mit der Polidase bei Zimmertemperatur über Nacht in-
kubiert und nach Behandeln mit Dowex 50 (H®-Form)
auf Papier (Laufmittel Phenol —Wasser 80 : 20) chro-
matographiert. Es wurden drei Zonen erhalten mit den
i?/-Werten 0,35 (Glycerinsäure), 0,55 (Fructose, etwa
50% der Radioaktivität) und 0,85 (Triosen).
Glucose-3.4-u C
Die Zonen der Fructose wurden mit Wasser in etwa
7 ml eluiert, die Lösung mit einer Mischung von Do-
wex 50 (H®-Form) und Dowex 2 (CO320-Form) be-
Fructose-1,6-diphosphat-(3.4-14C)
handelt und zur Trockene lyophilisiert. Der Rüdestand
wurde in 2,0 ml behandelt mit (in //Molen) : Tris-HCl-
Puffer ph = 8,0 100; MgCl2 10; Äthylendiamin-tetra-
acetat 10; Adenosin-triphosphat 5; 0,5 mg Hexokinase
(Sigma, Typ IV, crude, from yeast) und 10 jug Phos-
phoglucose-Isomerase (4 Einheiten; Fa. Boehringer).
Der Ansatz enthielt in einem Volumen von 6,0 ml in
//Molen: 3-Phosphoglycerinsäure-l-14C 40; Tris-HCl-
Puffer ph = 8 400; MgCl2 20; reduziertes Glutathion 10;
Athylendiamin-tetraacetat 10; Adenosin-triphosphat
70; NADH2 50; und folgende Enzyme (Fa. Boehrin-
ger) (in /ug) : Phosphoglyceratkinase 20 (3,5 Einhei- Nach IStde. bei Zimmertemperatur wurde eine Probe
ten) ; Triosephosphatdehydrogenase 200 (5 Einheiten) ; zum optischen Test nach W a r b u r g entnommen. Da-
Triosephosphatisomerase 20 (55 Einheiten) und Aldo-
lase 200 (3,5 Einheiten). Es wurde bei Zimmertempe-
ratur inkubiert und der NADH2-Verbrauch in Proben
nach enthielt die Lösung 11 //Mole Hexosephosphate
(Glucose- und Fructose-6-phosphate). Das ergibt eine
Ausbeute von 55%, bezogen auf die beim zweiten
durch die Extinktion bei 340 m// bestimmt. Nach Schritt eingesetzten 40 //Mole Phosphoglycerinsäure.
3 Stdn. ergab sich eine Abnahme um 27 //Mole (67% Nach 1x/2 Stdn. wurde der Reaktionsansatz mit
der eingesetzten 3-Phosphoglycerinsäure). Die Reak- 0,2 ml 10-proz. Essigsäure angesäuert und U/s Min. auf
tion wurde durch Zusatz von 0,4 ml Eisessig gestoppt
und die Lösung zunächst mit 1 g Dowex 50 (H®-Form),
dann zur Entfernung der Nucleotide (Kontrolle durch
Messung der Lichtabsorption einer Probe bei 260 und
dem siedenden Wasserbad erhitzt. Nach Abkühlen auf
Zimmertemperatur wurde mit 2-n. Natronlauge gegen
Methylrot ein ph von 5,5 eingestellt und 0,5 ml 2-m.
Acetatpuffer pn = 5,5, 5 //Mole MgCl2 und 0,5 ml der
280 m//) mit 0,8 g Norit A (mit 10-proz. Essigsäure ge- obigen Polidaselösung zugesetzt.
waschen, dann mit 3-10~3-m. Fructosediphosphat in
10-proz. Essigsäure behandelt und gründlich mit Was-
Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie unter Fruc-
tose-3.4-14C beschrieben. Die papierchromatographische
ser nachgewaschen) behandelt. Dowex 50 und Norit A Trennung lieferte zwei Zonen mit den ungefähren Rf-
wurden mit einigen ml Wasser gewaschen und die ver-
einigten Filtrate durch Lyophilisieren eingeengt. Die 0,57 (Fructose; 35% der Radioaktivität).
Werten 0,38 (Glucose; 65% der Radioaktivität) und
Chromatographie erfolgte wie unter „3-Phosphogly-
cerinsäure-l-14C“ angegeben.
Wir sind der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s -
g e m e i n s c h a f t für ihre Unterstützung dankbar.
9 L. H o r e c k e r , J . H u r w it z u . P. K . S tu m p f, in: S . P. C o lo w ic k
and N. O. K a p l a n , 1. c. 8, Bd. Ill, S , 193.
8 E. R a c k e r , in: S. P. C o lo w ic k and N. O. K a p l a n , Methods in
Enzymology, Bd. V, S. 226, Academic Press, New York and
London 1962.
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FIEDLER
