NOTIZEN
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und zur Hydroxylierung weiterer Ansätze zu verwen-
den. Unter den gewählten Versuchsbedingungen stellen
die Bakterien also spezifische Hydroxylierungs-Kataly-
satoren dar. Der Fortgang der Hydroxylierung läßt sich
durch UV-Spektroskopie des Mediums verfolgen; die
Spektren des Nicotins (f259 = 5,4 [cm2/,wMol]) und
des 6-Hydroxynicotins (£231 = 12,85 [c m ^ M o l], f295
Methode zur mikrobiologischen Gewinnung; der
optischen Antipoden des 6-Hydroxynicotins
M. G l o
G
e r und K. D e c k e r
Biochemisches Institut an der Medizinischen Fakultät
der Universität Freiburg im Breisgau
(Z. Naturforschg. 21 b, 140 [1969] ; eingegangen am 4. Oktober 1968)
=
5,9 [cm2///M ol]) in 0,1 N HCl ermöglichen eine
einfache spektrophotometrische Gehaltsbestimmung 2’4.
Arbeitsvorschrift: Die Bakterien des Stammes II
werden auf dem folgenden Medium gezüchtet: 10,2 g
K2H P04 , 4,0 g KH2P 0 4 , 1,0 g Ammoniumsulfat, 3,0 g
Glycerin, 1,0 g Hefeextrakt, 10 ml einer Spurenelement-
Lösung (2,0 g CaCl2-H20, 1,0 g M nS04-7 H 20 , 1,0 g
FeS04-7H 20 und 5,0 g M gS04-7 H 20, suspendiert in
100 ml 0,1 N HCl) ; End-pH des Mediums 6,5, Wachs-
tumstemperatur 31 °C. Die Zellen werden nach 8 —10
L- und D-6-Hydroxynicotin (1) sind die ersten Ab-
bauprodukte des L- bzw. D-Nicotins durch das Boden-
bakterium Arthrobacter oxydans 1*2. Die Gewinnung
der reinen optischen Antipoden von (1) ist möglich
( 1)
Stdn. geerntet und in 0,05
diert.
m
Phosphatpuffer suspen-
a) durch chemische Synthese nach
T s c h i T s c h i b a b i n 3 ;
Zur Hydroxylierung werden ca. 2 g Feuchtzellen in
1 l einer Lösung suspendiert, die 0,05 M Phosphatpuf-
fer und 0,1 M L- bzw. D-Nicotin bei einem End-pH von
6,5 enthält. Die Suspension wird bei 31 °C unter Schüt-
teln inkubiert, bis das gesamte Nicotin hydroxyliert
(Spektrum) ist. Die Zellen werden abzentrifugiert und
gegebenenfalls zur neuerlichen Hydroxylierung einge-
setzt. Der zellfreie Überstand wird auf pH 10,5 ge-
bracht und zur Trockne eingeengt. Der mit P20 5 ge-
trocknete Rückstand wird fein zermahlen und im
S o x h 1e t - Apparat mit Äther erschöpfend extrahiert.
Der Äther wird abgezogen und (1) dreimal aus Petrol-
das zunächst entstehende Racemat kann jedoch nur
durch einen großen Aufwand an Zeit und Material in
die Stereoisomeren aufgespalten werden, b) durch Iso-
lierung der optischen Antipoden aus Kulturmedien des
Arthrobacter oxydans; auch dieses Verfahren liefert
nur geringe Ausbeuten, da sowohl die stationäre Kon-
zentration der Substanz niedrig als auch die Reindar-
stellung durch störende Beiprodukte verlustreich ist.
c) durch Umsetzung von D - bzw. L-Nicotin mit Enzym-
extrakten aus Arthrobacter oxydans nach
r i T T e n b e r G 1
und r 2 ; dieses Verfahren erfordert wegen der
D
e c k e
geringen Ausbeute den Einsatz erheblicher Bakterien-
mengen.
äther
(Sdp. 100 —140 °C)
umkristallisiert. Der
Schmelzpunkt der erhaltenen Produkte beträgt 120
bis 121 °C, die Ausbeute 80% (bezogen auf das einge-
setzte Nicotin). Die UV- und fR-Spektren sind mit den
früher beschriebenen1’2 identisch. Die optische Rein-
heit der Produkte wurde durch Bestimmung des Dreh-
wertes zwischen 366 und 589 nm gesichert. In wäßriger
Lösung findet man die folgenden spezifischen Drehun-
gen:
Von besonderem Interesse war daher die Beobach-
tung, daß ein durch Anreicherungskultur auf Nicotin
erhaltenes, gram-negatives Stäbchen (Stamm II) die
optischen Antipoden des Nicotins in 6-Stellung zu
hydroxylieren vermag und die dabei entstandenen
6-Hydroxvnicotine fast quantitativ in das Medium ab-
gibt. Im Gegensatz zu Arthrobacter oxydans bildet die-
ses Bakterium aus Nicotin unter den gewählten Bedin-
gungen keinen blauen Farbstoff.
M 20
Die Hydroxylierung des D - bzw. L-Nicotins gelingt
nicht nur mit wachsenden Kulturen des Stammes II, die
neben Nicotin eine andere Kohlenstoffquelle (Glucose
oder Glycerin) enthalten, sondern auch mit ruhenden
Zellen. Das hat den Vorteil, daß Komponenten des
Nährmediums die Aufarbeitung nicht stören und mit
verhältnismäßig kleinen Volumina gearbeitet werden
kann. Es ist möglich, die Zellen nach einem Umsatz
durch Zentrifugieren aus dem Medium zu entfernen
L - ( l)
D - ( l)
589 nm
546 nm
366 nm
-
-
-
64.4°
77,8°
263,9°
+
+
+
62,8°
77.3°
259.5°
Für die Unterstützung dieser Arbeit sind wir der Freibur-
ger Wissenschaftlichen Gesellschaft und der Firma Boehrin-
ger, Mannheim, zu Dank verpflichtet.
1 L. I. h o c h s T e i n u . S. C. r i T T e n b e r G , J. biol. Chemistry
234, 156 [1959].
A. E. T s c h i T s c h i b a b i n u . A. W. k r i s s a n o w , Ber. dtsch.
chem. Ges. 57,1163 [1924].
2
k . D e c k e r , h . e b e r w e i n , F. A. G r ie s u . M. b r ü h m ü l l e r ,
Biochem. Z. 334, 227 [1961].
L. I. h o c h s T e i n u . S. C. r i T T e n b e r G , J. biol. Chemistry
234, 151 [1959].
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