The Sphingosine and Acyl Chains of Ceramide [NS] Show Very Different Structure and Dynamics That Challenge Our Understanding of the Skin Barrier

Article abstract of DOI:10.1002/anie.202003375

The lipid phase of the uppermost human skin layer is thought to comprise highly rigid lipids in an orthorhombic phase state to protect the body against the environment. By synthesizing sphingosine-d₂₈ deuterated N-lignoceroyl-d-erythro-sphingosine (ceramide [NS]), we compare the structure and dynamics of both chains of that lipid in biologically relevant mixtures using X-ray diffraction, ²H NMR analysis, and infrared spectroscopy. Our results reveal a substantial fraction of sphingosine chains in a fluid and dynamic phase state at physiological temperature. These findings prompt revision of our current understanding of the skin lipid barrier, where an extended ceramide [NS] conformation is preferred and a possible domain structure is proposed. Mobile lipid chains may be crucial for skin elasticity and the translocation of physiologically important molecules.

Full text of DOI:10.1002/anie.202003375

A Journal of the Gesellschaft Deutscher Chemiker
Angewandte
Chemie
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Accepted Article
Title: The Sphingosine and Acyl Chains of Ceramide [NS] Show Very
Different Structure and Dynamics Challenging Our Understanding
of the Skin Barrier
Authors: Oskar Engberg, Andrej Kováčik, Petra Pullmannová, Martin
Juhaščik, Lukáš Opálka, Daniel Huster, and Kateřina Vávrová
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The Sphingosine and Acyl Chains of Ceramide [NS] Show Very
Different Structure and Dynamics Challenging Our Understanding
of the Skin Barrier
Oskar Engberg,#[a] Andrej Kováčik,#[b] Petra Pullmannová,#[b] Martin Juhaščik,[b] Lukáš Opálka,[b] Daniel
Huster,*[a],[c] Kateřina Vávrová*[b]
# these authors contributed equally
[a]
[b]
[c]
Dr. O. Engberg, Prof. Dr. D. Huster
Institute of Medical Physics and Biophysics, University of Leipzig
Härtelstr. 16-18, 04275 Leipzig, Germany
E-mail: daniel.huster@medizin.uni-leipzig.de
Dr. A. Kováčik, Dr. P. Pullmannová, M. Juhaščik, Dr. L. Opálka, Prof. Dr. K. Vávrová
Skin Barrier Research Group, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Charles University
Akademika Heyrovského 1203, 50005 Hradec Králové, Czech Republic
E-mail: katerina.vavrova@faf.cuni.cz
Prof. Dr. D. Huster
Department of Chemical Science, Tata Institute of Fundamental Research
Dr. Homi Bhabha Road, Colaba, Mumbai 400 005, India
Supporting information for this article is given via a link at the end of the document.
Abstract: The lipid phase of the uppermost human skin layer is
thought to comprise highly rigid lipids in an orthorhombic phase state
to protect the body against the environment. By synthesizing sphin-
gosine-d28 deuterated N-lignoceroyl-D-erythro-sphingosine (cerami-
de [NS]), we compare the structure and dynamics of both chains of
ced to represent the basis for the skin’s barrier function. How-
ever, the biophysical methods used to study the SC may impose
some dynamical bias. Diffraction techniques are sensitive to or-
dered structures and thus most suited to describe the rigid
2
phase of lipid layers.[3;10] Solid-state H NMR relies on isotopic
2
that lipid in biologically relevant mixtures using X-ray diffraction, H
labeling, limited to specific molecular segments as provided by
chemical synthesis. Thus, the information is constrained to the
labeled moieties and only provides a restricted and possibly bi-
ased view on the dynamic behavior of the molecules. In SC re-
NMR and infrared spectroscopy. Our results reveal a substantial
fraction of sphingosine chains in a fluid and dynamic phase state at
physiological temperature. These findings prompt revision of our cur-
rent understanding of the skin lipid barrier, where an extended cera-
mide [NS] conformation is preferred and a possible domain structure
is proposed. Mobile lipid chains may be crucial for skin elasticity and
the translocation of physiologically important molecules.
2
search, H labeling is available for the Cer acyl chains, the fatty
acids, or Chol, which were shown as highly rigid in many stu-
dies.[4;5;12] Methods that do not require isotopic enrichment (13C
MAS NMR[6] or FTIR[7;8]) are confronted with dynamic range pro-
blems as the highly intense NMR peaks or vibrational bands of
the chain methylene groups renders detection of low intensity
signals very difficult. These segments, however, could feature
an alternative dynamic signature. In that regard, the recent ob-
servations that the oleic[9] or linoleic acyl chain[10;13] moieties of
the ultra-long chain Cer[EOS] in SC mixtures are isotropically
mobile in SC mixtures at physiological temperature while all
other lipids remained orthorhombic and rigid caused attention.
These new findings prompt the question if also other segments
of highly abundant Cer molecules in the SC that have eluded
detailed investigation so far could possibly exhibit higher mobility.
The most prominent structural moiety that has not been studied
up to now is the sphingosine backbone. To close this crucial gap,
we synthesized the most canonical Cer molecule Cer[NS] with a
perdeuterated sphingosine and studied the dynamic properties
of that chain. Up to now, only the acyl chain moiety of Cer[NS]
has been deuterated and all results about its mobility and phase
state have been derived from such species.[5;9]
For several decades, the lipid phase of the uppermost human
skin layer, the stratum corneum (SC), has been described as a
continuous assembly of highly ordered and rigid lipids.[1] The SC
is crucial for survival on dry land as it protects the body against
excessive loss of water and penetration of harmful xenobiotics.
The SC lipids consist of an approximate equal molar mixture of
ceramides (Cer) of varying polar head structures and chain
lengths, free fatty acids, and cholesterol (Chol). Unlike phospho-
lipid bilayers, the SC lipids form multilamellar assemblies with
very low water content of 1-2 water molecules per lipid head-
group.[2] Most structural insight comes from X-ray and neutron
diffraction,[3] 2H and 13C MAS NMR,[4-6] and Fourier transform in-
frared (FTIR) spectroscopy.[7;8] At physiological skin temperature
(32°C), these methods have reported a coherent model descri-
bing the SC lipid phase as densely packed orthorhombic/ hexa-
gonal layers forming either a short (SPP) or a long periodicity
phase.[3] Dynamic lipids are only detected at high/unphysiologi-
cal temperatures.[5;9;10]
Cer[NS]-sph-d28 was constructed by cross-metathesis of per-
deuterated pentadec-1-ene (3) with protected C5-sphingosine (5)
(Scheme 1). First, perdeuterated pentadecan-1-ol (1) was dehy-
drated by Grieco protocol;[14] the yields of selenide (2) formation
(96%) and its H2O2 oxidation to pentadec-1-ene-d30 (3) (96%)
Considering the highly dynamic nature of physiological lipid
membranes,[11] it is remarkable that the skin lipids form a highly
rigid phase. Consequently, this phase state has been pronoun-
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2
were comparable to those reported for unlabeled compounds.[14]
This facile generation of deuterated terminal alkenes opens fur-
ther possibilities for synthesis of specifically deuterated com-
pounds for applications in the life sciences[15] as terminal alke-
nes are ideal substrates for numerous chemical transforma-
tions.[16] Cross-metathesis of pentadec-1-ene-d30 (3) with pro-
tected C5-sphingosine (5), prepared by vinylation of (S)-Garner
aldehyde (4), proceeded in 37±5% yield (n=3) to the protected
sphingosine-d28 (6). This yield is significantly lower compared to
Cer[NS]/LA/Chol mixtures. H NMR spectra of high quality were
detected indicating very homogeneous preparations.
From 2H NMR spectra, the structure and dynamics of either
Cer[NS] chain was derived. We used numerical lineshape simu-
lations to determine structural and dynamical parameters of ei-
ther chain and quantify the relative proportions of the phases
formed.[4;5] These simulations reproduce spectral lineshapes for
rigid (all-trans) lipid chains assuming a static electric field gra-
dient (EFG) tensor, or consider the effect of motions partially
that of the metathesis of unlabeled pentadec-1-ene (57±1%; n=3, averaging the EFG tensor relevant for lipid chains undergoing 2-
p<0.05), which may be consistent with a secondary kinetic iso-
tope effect resulting from the sp3 to sp2 hybridization change of
the metallacycle carbons during breakup.[17] Sphingosine-d28 (6)
was deprotected and acylated to yield the final Cer[NS]-sph-d28.
Cer[NS]-acyl-d47 with deuterated C24-acyl chain was prepared by
acylating sphingosine with lignoceric acid-d47.[18]
site jumps, trans-gauche isomerization, or isotropic motions
(vide infra). The Cer[NS]-acyl-d47 lignoceroyl chain showed a
predominant orthorhombic phase state at 25 and 32°C in both
mixtures. Such NMR spectra are obtained for rigid all-trans acyl
chains.[5;12] Only the methyl groups undergo three-site hopping
reducing the quadrupolar splitting by 1/3.[21] In stark contrast, the
Cer[NS]-sph-d28 sphingosine moiety shows much different NMR
spectra featuring two contributions. The first represents an inten-
sity distribution characteristic for the gel phase known from
phospholipid membranes below the main phase transition.[22]
Such 2H NMR spectra have been described for the C16 acyl
chains of Cer[NS] assuming a 2-site-exchange model.[5] In the 2-
site exchange model, the all-trans chains interchange about their
long molecular axis with a jump angle of 180°. Indeed, this
2
model explains the broad base of the H NMR spectra of sphin-
gosine-d28. In addition, the NMR spectra contain a narrow com-
ponent that was simulated by a superposition of Pake doublets
scaled by relatively low order parameters. This combination of
powder line shapes exactly explains the experimental NMR
spectra (Fig. 1A).
Scheme 1. Chemical synthesis of deuterated Cer[NS]-sph-d28
.
With the new compound in hand, we prepared two standard mix-
tures of Cer[NS], lignoceric acid (LA) and Chol at molar ratios of
1:1:1 and 1:1:0.45. The latter was prepared to avoid a crystalline
Chol phase that had been observed before.[19;20] This model
represents the major lipid classes in correct proportions and, al-
though it does not fully capture the structural heterogeneity of
ceramides and fatty acids as it is technically not possible (these
lipids comprise over 1000 chemically distinct molecules), it
retains the characteristic very long saturated chains of these
lipids. Our lipid models also mimic the multilamellar assemblies
with dominant orthorhombic chain packing as shown by the X-
ray diffraction experiments that were carried out (Supplementary
Fig. S1) on non-oriented samples after NMR measurements.
Well resolved Bragg peaks up to the 6th order were obtained pro-
viding repeat distances of 53.8 and 53.9 Å, respectively, charac-
teristic for the SPP.[3] The high Chol sample also showed a se-
parated Chol phase with a d(001) reflection corresponding to 34.5
Å.[3] In the wide-angle region, both samples showed two reflec-
tions corresponding to distances between lattices of d = 4.1 and
3.7 Å, characteristic for orthorhombic chain packing.[3]
Figure 1. A) Static 2H NMR spectra (black) of the SC lipid model mixture
composed of Cer[NS]/LA/Chol at molar ratios of 1:1:0.45 (left two columns)
and 1:1:1 (right two columns) at varying temperatures. The 1st and the 3rd
column display the 2H NMR spectra of the Cer[NS]-sph-d28 (deuterated
sphingosine-d28). Columns 2 and 4 show the NMR spectra of the Cer[NS]-
acyl-d47 (perdeuterated lignoceroyl-d47). Simulated spectra are shown in red.
The multilamellar lipid preparations contained 50 wt% buffer (0.1 M MES, 0.1
M NaCl, 5 mM EDTA, pH 5.4). B) Relative proportions of the individual phases
observed in the mixtures.
From the simulations of the NMR spectra, the relative propor-
tions of each phase were determined (Fig. 1B and Supplemen-
tary Table S1). At 25°C and 32°C, the high and the low Chol
mixtures behave very similarly. At both temperatures, the majo-
rity (84-98%) of the lignoceroyl-d47 acyl chain of Cer[NS] forms
an orthorhombic phase in agreement with previous reports.[4;5;9]
At high Chol, a very small fluid fraction is observed. However,
2
Next, the Cer[NS] in the mixtures was studied by solid-state H
NMR (Fig. 1). Cer[NS] was deuterated either in the acyl chain
(Cer[NS]-acyl-d47) or in the sphingosine moiety (Cer[NS]-
sph-d28). Thus, the structure and dynamics of each hydrocarbon
chain could be studied individually providing a complete over-
view of the thermotropic phase behavior of Cer[NS] in
2
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completely different phases were observed for the deuterated
sphingosine-d28. The NMR spectra indicate major contributions
(between 45% and 74%) from sphingosine chains that are sub-
ject to 2-site exchange processes. Very surprisingly, a substan-
tial amount (between 26% and 32%) of the sphingosine is highly
niscent of the liquid-ordered phase observed for sphingomyelin
in raft mixtures.[26;27] The sphingosine moiety is entirely fluid
and/or isotropic. In the isotropic phase, the multilayer structure
of the SC model is fully abolished but lamellar structures are
2
formed again when the temperature is decreased. The H NMR
2
fluid indicated by very narrow H NMR spectral components. In
spectra can be well simulated assuming axially symmetric reori-
entations of the molecules along their long axis and a gradient of
molecular order that is decreasing towards the end of the chain.
this state, the sphingosine chains are very disordered under-
going motions with large amplitudes on the order of 40°. While
the orthorhombic lignoceroyl moieties and the sphingosine
chains undergoing 2-site exchange exhibit rigid C-2H bond vec-
tors that do not exhibit any fluctuations at all, the fluid sphingo-
sine chains show an order parameter profile indicative of large
amplitude motions for the methylene segments (Fig. 2A). Order
parameters decrease very steeply from the upper chain seg-
ments to the chain end as observed for inverse hexagonal pha-
ses of lipid membranes,[23] concomitant with increased spatial
requirements of the fluid sphingosine chains.
It is very instructive to compare the geometrical parameters of
the lignoceroyl and the sphingosine chains of Cer[NS] at physio-
logical skin temperature (32°C). The lignoceroyl chain is in an
all-trans state (length l = 29.2 Å). The sphingosine chains under-
going 2-site exchange are also all-trans (l = 17.8 Å). In contrast,
the fluid sphingosine chains are disordered by fast trans-gauche
isomerizations. Using analytical models,[24] the average length of
the dynamic sphingosine moiety was calculated from the order
parameters. Rapid trans-gauche isomerizations lead to a de-
crease in the chain length to 13.0 Å for the high and 12.7 Å for
the low Chol mixtures. Thus, each sphingosine chain contains
on average 4.3 or 4.6 gauche defects at 32°C (one gauche de-
fect reduces the chain length by 1.1 Å).[25] The lengths of chains
of Cer[NS] subject to different molecular packing and dynamics
are illustrated in Fig. 2B.
2
These assumptions lead to a perfect description of the H NMR
spectra with order parameter profiles shown in Fig. 2A. Both
chains feature similar order parameters for the upper half of the
chain while order decreases steeper for the shorter sphingosine
moiety towards the end of the chain. The presence of Chol leads
to relatively large quadrupolar splittings observed under these
conditions. At high Chol concentration, the projected average
chain length for the lignoceroyl moiety on Cer[NS] is 23.3 Å,
suggesting that on average 5.3 C-C bonds are in the gauche
state. Similarly, the sphingosine moiety shows an average
length of 14.7 with 2.8 gauche defects per chain. At low Chol
content, for the lignoceroyl chain, the average chain length is
23.6 Å corresponding to 5.1 gauche defects. For the sphingo-
sine moiety, we calculate an average chain length of 14.9 Å,
which requires on average 2.7 gauche defects. Clearly, there is
no chain length match between the lignoceroyl chain and the
sphingosine moiety of Cer[NS]. At 80°C both deuterated chains
of Cer[NS] are fully isotropic (Supplementary Fig. S2).
The lipid mixture consisting of Cer[NS]/LA/Chol (1:1:1 molar
ratio, with 0.13 mol Chol-sulfate, a minor SC component) were
studied by FTIR. Fig. 2C shows that sphingosine is less ordered
than the acyl chain at 32°C as indicated by almost by 2 cm-1
higher wavenumber of the CD2 symmetric stretching bands con-
sistent with the number of gauche defects seen by NMR. Such
wavenumber shift is rather large for SC lipids. Wavenumbers
were increased by 0.4 cm-1 in patients with atopic dermatitis as
compared to healthy individuals.[28] The chain melting phase
transitions of the sphingosine (56°C) and lignoceroyl chains
(68°C) of Cer[NS] are clearly separated. Fig. 2D shows a well
resolved CH2 scissoring doublet in the mixture with Cer[NS]-
sph-d28 at 32°C. This doublet arising from CH2 vibrational coup-
ling indicates that the unlabeled chains (Cer acyl and LA) are or-
thorhombic and do not mix with the labeled sphingosine chains
as the coupling only occurs between the same isotopes. The or-
thorhombic doublet disappears at 37°C,[18] which agrees well
with the orthorhombic-hexagonal transition found in human
SC.[29;30] This pretransition is also consistent with the loss of the
crystalline phase between 32°C and 50°C seen by NMR.
There are several important structural consequences for our cur-
rent understanding of the SPP of the SC lipid barrier. (i) The two
chains of Cer[NS] show a very different dynamic behavior in
mixtures comprising major SC lipid classes. At physiological
temperature, where the lipid phase is predominantly orthorhom-
bic, about 1/3 to 1/4 of the sphingosine chains are highly dyna-
mic featuring low order parameters caused by rapid trans-
gauche isomerizations. Compared to all-trans chains such dyna-
mic sphingosine moieties occupy a 36% larger cross-sectional
area in the layers. Such an area increase in the tightly packed
SC will create defects possibly responsible for the (limited) per-
meability of the outer skin layer. (ii) Considering the very dif-
ferent dynamic states of the lipid chains of Cer[NS], a hairpin
model of this Cer is unlikely. Both the fluid and the sphingosine
chains in 2-site exchange require a symmetry axis for these mo-
Figure 2. Order parameter profiles (A), projected chain lengths (B) of the
Cer[NS] from NMR. FTIR methylene symmetric stretching wavenumbers (C)
and FTIR spectra of the CD2 and CH2 scissoring bands (D) of SC model
mixtures (Cer[NS]/LA/Chol, 1:1:1 molar ratios; 0.13 mol Chol-sulfate for FTIR).
At 50°C, both SC mixtures undergo restructuring. All NMR spec-
tra of the sphingosine as well as the lignoceroyl moieties indi-
cate fluid phases. While the sphingosine of the Cer[NS] is comp-
letely fluid, the lignoceroyl chain is still found to 53% in the ortho-
rhombic phase at low and to 6% at high Chol content. At 65°C,
the orthorhombic proportions of the lignoceroyl chains of
Cer[NS] have almost completely disappeared. The dominant
2
phase is the fluid state, characterized by H NMR spectra remi-
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tions that is parallel to the long axis of the molecule. Since no
indications for any such dynamics of the lignoceroyl moiety were
found in the 2H NMR spectra, the hairpin model of Cer[NS] in the
SC layers has to be rejected. Even with an all-trans lignoceroyl
chain conformation, the required axially symmetric rotation of
Cer[NS] would decrease the lignoceroyl order parameters to 0.5,
which was clearly not observed. Only an extended conformation
of Cer[NS], where the two chains could move independently,
would agree with our experimental data. Even at elevated tem-
peratures, we see very different dynamical features of the ligno-
ceroyl and the sphingosine chains that would not agree with the
hairpin conformation. (iii) To avoid large packing defects caused
by chain length mismatches of the dynamic and rigid chains at
the interface between orthorhombic lignoceroyl and highly mo-
bile sphingosine chains, it becomes likely that the lipid phase of
the SC shows a domain structure. Since the highly mobile and
fully extended sphingosine chains feature very different lengths,
a random distribution of lipids would produce frequent hydropho-
bic mismatches that are energetically highly unfavorable. These
situations are avoided by clustering mobile and rigid chains, re-
spectively, minimizing the interface between the domains cha-
racterized by very different chain lengths. Such fluctuations in li-
pid distribution would also agree with modern models of fluid
biological membranes.[26;27] Taken together, (iv) with the new
structural data reported here, we suggest a model of the SPP of
the SC mixture as sketched in Fig. 3. At skin temperature, the
Cer molecules are in an extended conformation and highly mo-
bile and highly rigid chain moieties are likely to cluster together
introducing heterogeneities and fluctuations to the lipid phase of
the SC. Such mobile SC lipid chains may be important to main-
tain skin elasticity and enable translocation of physiologically im-
portant molecules, such as water, cytokines and antimicrobial
peptides, which is consistent with the current view on the SC
sensory and defensive functions. Thus, with the current and two
recent[9;10] reports on the high mobility of specific segments of
Cer molecules in the SC it appears that the models of the lipid
structures of the outermost layer of human skin will have to be
revised to consider more molecular disorder and dynamics of
the lipids under physiological conditions.
0000841) co-funded by ERDF. O E. acknowledges the Sigrid
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Keywords: chain conformation • lipids • membranes •
nanostructure • NMR spectroscopy
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Acknowledgements
[30] M. de Jager, W. Groenink, J. van der Spek, C. Janmaat, G. Gooris, M.
Ponec, J. Bouwstra, Biochim. Biophys. Acta 2006, 1758, 636-644.
This work was supported by the Czech Science Foundation and
German Research Foundation (19-09135J and HU 720 18/1)
and the project EFSA-CDN (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/
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Dynamic chains in a rigid matrix. While originally assumed to be fully rigid, our spectroscopic data reveals that sphingosine chains
of ceramide molecules in the outermost human skin layer exhibit a comprehensive dynamical behavior allowing to fine tune our
understanding of the molecular details of the skin barrier.
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Die unterschiedliche Struktur und Dynamik der Sphingosin- und
Acylketten von Ceramid [NS] verändern unser Verständnis der
Struktur der Hautbarriere
Oskar Engberg,#[a] Andrej Kováčik,#[b] Petra Pullmannová,#[b] Martin Juhaščik,[b] Lukáš Opálka,[b] Daniel
Huster,*[a],[c] Kateřina Vávrová*[b]
# Diese Autoren haben zu gleichen Teilen zu der Arbeit beigetragen.
[a]
[b]
[c]
Dr. O. Engberg, Prof. Dr. D. Huster
Institut für Medizinische Physik und Biophysik, Universität Leipzig
Härtelstr. 16-18, 04275 Leipzig, Germany
E-mail: daniel.huster@medizin.uni-leipzig.de
Dr. A. Kováčik, Dr. P. Pullmannová, M. Juhaščik, Dr. L. Opálka, Prof. Dr. K. Vávrová
Skin Barrier Research Group, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Charles University
Akademika Heyrovského 1203, 50005 Hradec Králové, Czech Republic
E-mail: katerina.vavrova@faf.cuni.cz
Prof. Dr. D. Huster
Department of Chemical Science, Tata Institute of Fundamental Research
Dr. Homi Bhabha Road, Colaba, Mumbai 400 005, India
Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind über den Link am Ende des Dokumentes zu erhalten.
Abstract: Im Modell der äußeren Hautschicht wird die Lipidphase
durch sehr rigide Moleküle in einer orthorhombischen Phase gebildet, bei hohen, unphysiologischen Temperaturen beobachtet.[5;9;10]
(LPP) Periodizität vorliegen.[3] Dynamische Lipide werden nur
die den Körper vor Umwelteinflüssen schützt. Durch Synthese von
Sphingosin-d28-deuteriertem N-lignoceroyl-D-erythro-sphingosin (Ce-
ramid [NS]) waren wir in der Lage die Struktur und Dynamik beider
Betrachtet man dagegen den hochdynamischen Charakter phy-
siologischer Lipidmembranen,[11] so ist diese rigide Phase der
Hautlipide bemerkenswert. Deshalb wird diese Lipidstruktur als
Grundlage der Barrierefunktion der Haut verstanden. Jedoch
Lipidketten in biologisch-relevanten Mischungen mittels Röntgendif-
2
fraktion, H-NMR- und Infrarot-Spektroskopie vergleichen zu können. könnten die verwendeten Methoden die dynamischen Eigen-
Unsere Ergebnisse zeigen, dass bei physiologischer Temperatur ein
substantieller Teil der Sphingosin-Ketten in einer fluiden und dyna-
mischen Phase vorliegen. Diese Ergebnisse bedingen eine Modifi-
zierung unseres Verständnisses der Hautlipidbarriere, nach der eine
gestreckte Konformation von Ceramid [NS] bevorzugt und eine Do-
mänenstruktur vorgeschlagen wird. Bewegliche Lipidketten könnten
essentiell für die Hautelastizität und die Permeation wichtiger Mole-
küle sein.
schaften der Hautlipide unterschätzen. Diffraktionstechniken de-
tektieren nur hoch geordnete Strukturen und sind daher für die
Untersuchung rigider Strukturen geeignet.[3;10] Festkörper-2H
NMR bedingt spezifische Isotopenmarkierung, die nur für be-
stimmte Molekülsegmente chemisch möglich ist. Daher stehen
nur eingeschränkte Informationen der isotopenmarkierten Seg-
mente zur Verfügung, wodurch der dynamische Charakter der
Hautlipide unterschätzt werden könnte. 2H-Markierung steht mo-
mentan nur für die Cer-Acylketten, die FFS und Chol-Segmente
zur Verfügung, die sich in vielen Studien als sehr starr erwie-
sen.[4;5;12] Methoden, die keine Isotopenmarkierung bedingen wie
13C-MAS-NMR-[6] oder IR-Spektroskopie,[7;8] sind oft unempfind-
lich für Signale geringer Intensität, deren Detektion aufgrund
technischer Beschränkungen angesichts sehr intensiver NMR-
Signale und IR-Banden erschwert ist. Diese Segmente könnten
allerdings eine alternative dynamische Signatur aufweisen. In
diesem Zusammenhang erregten jüngst veröffentlichte Ergeb-
nisse Aufsehen: Es wurde gezeigt, dass bei Hauttemperatur die
Öl-[9] bzw. Linolsäureketten [10;13] von Cer[EOS]-Molekülen in SC-
Mischungen isotrop beweglich sind, während alle anderen Lipide
in orthorhombischer Phase vorliegen.
Nach dem gültigem Modell wird die äußere Hautschicht, das
stratum conreum (SC), als kontinuierliche Phase hoch geord-
neter Lipide beschrieben.[1] Die Entwicklung des SC war essen-
tiell für das Überleben an Land aufgrund der protektiven Wirk-
ung gegen Wasserverlust des Körpers und Schutz gegen die
Penetration von Xenobiotika. Die Lipidphase des SC wird von
einer etwa äquimolaren Mischung aus Ceramiden (Cer) unter-
schiedlicher Kopfgruppenstrukturen, freien Fettsäuren (FFS)
unterschiedlicher Länge und Cholesterin (Chol) gebildet. Im
Gegensatz zu Phospholipidbilayern bilden die Lipide des SC
multilamellare Schichten mit einem sehr geringen Wassergehalt
von lediglich 1-2 Wassermolekülen pro Lipidkopfgruppe.[2] Zum
strukturellen Verständnis des Aufbaus des SC haben Methoden
wie Röntgendiffraktion,[3] 2H- und 13C-MAS-NMR-,[4-6] sowie In-
frarot-Spektroskopie (IR) beigetragen.[7;8] Bei Hauttemperatur
(32°C) lieferten diese Methoden ein kohärentes Modell, nach
dem die SC-Lipide als dicht gepackte orthorhombische bzw.
hexagonale Lipidschichten mit einer kurzen (SPP) oder langen
Diese neuen Ergebnisse bedingen die Frage, ob auch andere
Segmente von hoch abundanten Cer-Molekülen im SC, die bis-
her noch nicht detailliert untersucht wurden, möglicherweise
auch eine höhere Dynamik aufweisen. Dies betrifft vor allem das
bisher noch nicht spektroskopisch untersuchte Sphingosin-
Rückgrat. Um diese wichtige Lücke zu schließen, synthetisierten
wir das am häufigsten vorkommende Cer[NS] mit deuteriertem
Sphingosin und studierten seine dynamischen Eigenschaften.
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Bisher wurde nur die Acylkette von Cer[NS] deuteriert und seine
dynamischen Eigenschaften charakterisiert.[5;9]
kette separat untersucht und ein umfassender Überblick über
das thermotope Phasenverhalten von Cer[NS] in der Cer[NS]/
LS/Chol-Mischung erhalten werden. 2H-NMR-Spektren hoher
Qualität deuteten auf homogene Präparationen hin.
Cer[NS]-sph-d28 wurde durch gekreuzte Metathese von per-
deuteriertem Pentadec-1-en (3) mit geschütztem C5-Sphingosin
(5) synthetisiert (Schema 1). Zunächst wurde perdeuteriertes
Pentadecan-1-ol (1) nach dem Grieco-Protokoll dehydriert.[14]
Die Ausbeuten der Selenid- (2) Bildung (96%) und der H2O2-Oxi-
dation zu Pentadec-1-en-d30 (3) (96%) waren vergleichbar zu
unmarkierten Komponenten.[14] Die Bildung deuterierter Alkene
eröffnet weitere Möglichkeiten für die Synthese spezifisch deute-
rierter Moleküle,[15] da terminale Alkene ideale Substrate für ver-
schiedene chemische Transformationen darstellen.[16] Gekreuzte
Metathese von Pentadec-1-en-d30 (3) mit geschütztem C5-Sphin-
gosin (5) erzeugt durch Vinylierung von (S)-Garner-Aldehyd (4)
erfolgte in 37±5%iger Ausbeute (n=3) zum geschützten Sphin-
gosin-d28 (6). Diese Ausbaute war signifikant geringer verglichen
zur Metathese von unmarkiertem Pentadec-1-en (57±1%; n=3,
p<0.05) aufgrund eines Isotopeneffektes resultierend aus der
Veränderung der sp3- zur sp2-Hybridisierung der metallacyc-
lischen Kohlenstoffe während der Aufspaltung.[17] Sphingosin-d28
(6) wurde entschützt und zu Cer[NS]-sph-d28 acyliert. Cer[NS]-
acyl-d47 mit deuterierter C24-Acylkette wurde durch Acylierung
von Sphingosin mit Lignocerinsäure-d47 synthetisiert.[18]
Aus den 2H-NMR-Spektren wurden Informationen zur Struktur
und Dynamik jeder Kette von Cer[NS] abgeleitet. Strukturelle
und dynamische Parameter wurden aus numerischen Linien-
formsimulationen bestimmt sowie die relativen Anteile jeder
Phase ermittelt.[4;5] Die Simulationen reproduzierten die spektra-
len Linienformen für rigide Ketten in all-trans-Konformation, in-
dem ein statischer elektrischer Feldgradient- (EFG) Tensor an-
genommen wurde, oder betrachteten den Einfluss von Beweg-
ungen auf die partielle Ausmittelung des EFG-Tensors relevant
für Lipidketten, die 2-Seiten-Sprünge, trans-gauche-Isomerisier-
ungen oder isotrope Bewegungen ausführen. Die Lignoceryl-
kette von Cer[NS]-acyl-d47 zeigte nahezu vollständig eine ortho-
rhombische Phase bei 25 und 32°C in beiden Mischungen. Sol-
che NMR-Spektren werden für rigide all-trans-Acylketten erhal-
ten.[5;12] Nur die Methylgruppen führen Sprünge mit dreizähliger
Symmetrie aus, was die beobachtete Quadrupolaufspaltung auf
1/3 reduziert.[21] Im Gegensatz dazu lieferten die Sphingosin-
ketten von Cer[NS]-sph-d28 deutlich andere NMR-Spektren mit
zwei Beiträgen: der erste zeigt eine spektrale Intensitätsverteil-
ung, wie sie in Gelphasen von Phospholipidmembranen beob-
achtet wird.[22] Solche 2H-NMR-Spektren wurden für die C16-Ket-
ten von Cer[NS] unter Annahme von 2-Seiten-Sprüngen simu-
liert.[5] In diesem Model beträgt der Sprungwinkel der all-trans-
Ketten entlang der Molekülachse 180°. Tatsächlich kann dieses
Modell den breiten Anteil der 2H-NMR-Pulverspektren sehr gut
beschreiben. Zusätzlich wird eine schmale Komponente beob-
achtet, die in der Simulation durch eine Überlagerung von Pake-
Spektren simuliert wurde, die durch unterschiedliche Ordnungs-
parameter skaliert waren. Diese Kombination erlaubte die ex-
akte Beschreibung der experimentellen NMR-Spektren (Abb.
1A).
Schema 1. Chemische Synthese von deuteriertem Cer[NS]-sph-d28
.
Mit den so synthetisierten Molekülen wurden zwei Mischungen
aus Cer[NS], Lignocerinsäure (LS) und Chol in molaren Verhält-
nissen von 1:1:1 und 1:1:0.45 hergestellt. Letztere wurde ver-
wendet, um die Bildung einer kristalline Chol-Phase zu verhin-
dern.[19;20] Diese Modelle repräsentieren die Hauptlipidklassen in
korrekten Anteilen obwohl die Komplexität und strukturelle Hete-
rogenität nicht vollständig abgebildet ist. Diese Mischungen bil-
den die multilamellaren Schichten mit dominanter orthorhomb-
ischer Packung gut nach wie in Diffraktionsexperimenten an
nicht orientierten Proben nach den NMR-Messungen gezeigt
werden konnte (Abb. S1). Gut aufgelöste Bragg-Peaks bis zur 6.
Ordnung zeigten Wiederholabstände von 53,8 und 53,9 Å für
beide Proben charakteristisch für die SPP.[3] Die Probe mit ho-
hem Chol-Anteil zeigte eine separierte Chol-Phase mit einem
d(001)-Reflex bei 34,5 Å.[3] In der Weitwinkelregion zeigten beide
Proben zwei Reflexe die auf Gitterabstände von d = 4,1 und 3,7
Å, charakteristisch für orthorhombische Kettenpackung.[3]
Abbildung 1. A) Stationäre 2H-NMR-Spektren (schwarz) der SC-Lipidmisch-
ungen Cer[NS]/LS/Chol im molaren Verhältnis von 1:1:0.45 (linke Spalten) und
1:1:1 (rechte Spalten) bei unterschiedlichen Temperaturen. Die erste und drit-
te Spalte zeigt die 2H-NMR-Spektren von Cer[NS]-sph-d28 (deuteriertes Sphin-
gosin-d28). Spalten 2 und 4 zeigen die NMR-Spektren von Cer[NS]-acyl-d47
(perdeuterierte Lignocerlsäure-d47). Simulierte Spektren sind in rot dargestellt.
Multilamellare Lipidpräparationen mit 50 Gew.% Puffer (0.1 M MES, 0.1 M
NaCl, 5 mM EDTA, pH 5.4). B) Relative Phasenanteile der Mischungen.
2
Wir untersuchten das Cer[NS] in der Mischung mit H-Festkör-
Aus den Simulationen der NMR-Spektren wurden die relativen
Phasenanteile bestimmt (Abb. 1B und Tabelle S1). Bei 25°C und
32°C verhalten sich beide Mischungen sehr ähnlich. Bei beiden
per-NMR (Abb. 1). Cer[NS] war dabei entweder in der Acylkette
(Cer[NS]-acyl-d47) oder im Sphingosin (Cer[NS]-sph-d28) deute-
riert. So konnten Struktur und Dynamik jeder Kohlenwasserstoff-
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Temperaturen liegt die Mehrzahl (84-98%) der Lignoceryl-d47-
Acylketten von Cer[NS] in der orthorhombischen Phase vor wie
aus der Literatur bekannt.[4;5;9] Bei hohem Chol-Anteil wird eine
kleine fluide Fraktion beobachtet. Jedoch werden für das Sphin-
gosin-d28 vollkommen andere Phasen beobachtet. Die NMR-
Spektren zeigen an, dass größere Anteile (zwischen 45% und
74%) der Ketten 2-Seiten-Sprünge ausführen. Überraschender-
weise ist ein substantieller Anteil von 26% bzw. 32% des Sphin-
gosins hoch fluid, was durch schmale Anteile im 2H-NMR-
Spektrum angezeigt wird. In diesem Zustand sind die Sphingo-
sin-Ketten sehr ungeordnet und vollführen Bewegungen mit
Amplituden von bis zu 40°. Während die orthorhombischen Lig-
nocerylketten und die Sphingosin-Ketten, die 2-Seiten-Sprünge
ausführen durch rigide C-2H-Bindungsvektoren gekennzeichnet
sind und keinerlei Flukuationen zeigen, wird für die fluiden
Sphingosinketten ein Ordnungsparameterprofil erhalten, das
durch molekulare Bewegungen mit großen Amplituden der Me-
thylensegmente gekennzeichnet ist (Abb. 2A). Die Ordnungspa-
rameter nehmen sehr steil entlang der Kette ab ähnlich wie es
für hexagonale Phospholipidphasen beobachtet wird,[23] was mit
einer größeren Raumforderung dieser Ketten einher geht.
Es ist aufschlussreich die geometrischen Parameter der Ligno-
ceryl- und Sphingosinketten von Cer[NS] bei Hauttemperatur zu
vergleichen. Die Lignocerylketten liegen im all-trans–Zustand
vor und zeigen eine Länge von 29,2 Å. Die Sphingosinketten im
2-Seiten-Austausch sind ebenfalls im all-trans-Zustand (l = 17.8
Å). Im Gegensatz dazu sind die fluiden Sphingosinketten durch
schnelle trans-gauche-Isomerisierungen stark ungeordnet. Mit-
tels analytischer Modelle[24] kann die mittlere Kettenlänge der dy-
namischen Sphingosinketten aus den Ordnungsparametern be-
stimmt werden. Schnelle trans-gauche-Isomerisierungen führen
zu einer Verkürzung der Kettenlänge auf 13,0 Å für die Misch-
ung mit hohem und auf 12,7 Å für die Mischung mit niedrigem
Chol-Anteil. Das bedeutet, dass jede Sphingosinkette bei 32°C
im Mittel 4.3 bzw. 4.6 gauche-Defekte bildet (ein gauche-Defekt
reduziert die Kettenlänge um 1,1 Å).[25] Die Kettenlängen von
Cer[NS] in unterschiedlicher molekularen Packung und Dynamik
ist in Abb. 2B dargestellt.
Bei 50°C kommt es zu einer Restrukturierung beider SC-Mi-
schungen. Alle NMR-Spektren der Sphingosin- und Lignoceryl-
ketten zeigen eine fluide Phase. Während das Sphingosin von
Cer[NS] vollständig fluid vorliegt, werden für die Lignocerylketten
noch Anteile der orthorhombischen Phase gefunden (53% bei
niedrigen und 6% bei hohem Chol-Gehalt). Bei 65°C sind diese
Anteile nahezu vollständig verschwunden. Die dominierende
Phase ist der fluide Zustand wie aus 2H-NMR-Spektren, die cha-
rakteristisch für die geordnete Phase von Raft-Mischungen sind,
abzuleiten ist.[26;27] Das Sphingosin ist vollständig fluid und/oder
isotrop. In der isotropen Phase ist die multilamellare Struktur
vollkommen aufgehoben, jedoch werden solche Strukturen bei
Temperaturerniedrigung wieder gebildet. Die 2H-NMR-Spektren
können unter Annahme von axialsymmetrischer Rotationsdiffu-
sion der Lipide um die Längsachse mit einem Ordnungsparame-
tergradienten gut beschrieben werden. Diese Annahme führt zur
perfekten Beschreibung der experimentellen NMR-Spektren mit
dem Ordnungsparameterprofil wie in Abb. 2A gezeigt. Beide
Ketten zeigen ähnliche Ordnungsparameter für die obere Hälfte
der Kette, die jedoch für die kürzere Sphingosin-Kette steiler
zum Kettenende hin abfallen. Durch Chol werden recht große
Quadrupolaufspaltungen beobachtet. Bei hoher Chol-Konzen-
tration beträgt die projizierte mittlere Kettenlänge für die Ligno-
cerylkette von Cer[NS] 23.3 Å, was im Mittel 5.3 gauche–Defek-
ten entspricht. Die Sphingosinkette zeigt eine mittlere Länge von
14.7 Å mit 2.8 gauche-Defekten. Bei niedriger Chol-Konzentra-
tion wird für die Lignocerylkette eine mittlere Länge von 23.6 Å
bestimmt (5.1 gauche-Defekte). Für die Sphingosinkette berech-
neten wir eine mittlere Länge von 14.9 Å (2.7 gauche–Defekte).
Offensichtlich liegt ein großer Längenunterschied beider Ketten
von Cer[NS] vor. Bei 80°C liegt für Cer[NS] die isotrope Phase
vor (Abb. S2).
Eine Lipidmischung aus Cer[NS]/LS/Chol (1:1:1 mit 0.13 mol
Chol-Sulfat) wurde mittels IR-Spektroskopie untersucht. Abb. 2C
zeigt, dass das Sphingosin bei 32°C weniger geordnet (nahezu
2 cm-1 höhere Wellenzahlen der symmetrischen CD2-Streck-
schwinug) was konsistent mit der Zahl der gauche-Defekte ist,
die mittels NMR bestimmt wurden. Diese Wellenzahlverschieb-
ung ist sehr groß für SC-Lipide. Eine Erhöhung dieser Wellen-
zahlen um 0.4 cm-1 wurde in Patienten mit Neurodermitis im
Vergleich zu gesunden Individuen ermittelt.[28] Die Temperaturen
der Phasenübergänge der Sphingosin- (56°C) und Lignoceryl-
ketten (68°C) sind klar separiert. Abb. 2D zeigt ein gut aufge-
löstes CH2-Scherdublett bei 32°C. Dies bedeutet, dass die un-
markierten Ketten orthorhombisch vorliegen und sich nicht mit
den markierten Sphingosin-Ketten mischen da die Kopplung nur
zwischen gleichen Isotopen vorkommt. Das orthorhombische
Dublett verschwindet bei 37°C,[18] was dem orthorhombisch-hex-
agonalen Übergang entspricht, der im SC beobachtet wird.[29;30]
Dieser Vorübergang ist ebenfalls konsistent mit dem Verlust der
kristallinen Phase zwischen 32°C und 50°C aus der NMR.
Aus den Daten können wichtige strukturelle Schlussfolgerungen
für unser Verständnis der SPP der SC-Barriere gezogen werden.
(i) Die beiden Ketten von Cer[NS] zeigen eine sehr unter-
schiedliche dynamische Signatur in SC-Mischungen. Bei physio-
logischer Temperatur, wo die Lipidphase hauptsächlich ortho-
rhombisch vorliegt, sind etwa 1/3 bis 1/4 der Sphingosinketten
hochdynamisch und zeigen Ordnungsparameter typisch für
schnelle trans-gauche-Isomerisierungen. Im Vergleich zu den
all-trans-Ketten beanspruchen die dynamischen Sphingosin-
ketten eine um 36% größere Querschnittsfläche in den Schich-
Abbildung 2. Ordnungsparameterprofile (A), projizierte Kettenlängen (B) von
Cer[NS] aus NMR-Messungen. IR-Wellenzahlen der symmetrischen Streck-
schwingungen der Methylengruppen (C) und IR-Spektren der CD2 und CH2
Scherenbanden (D) der SC-Modelmischungen (Cer[NS]/LS/Chol, 1:1:1 mola-
res Verhältnis mit 0.13 mol Chol-Sulfat in IR-Messungen).
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ten. Durch diese größere Raumforderung im dicht gepackten SC
können Defekte entstehen, die für die Permeabilität der äußeren
Hautschichten verantwortlich sind. (ii) In Anbetracht der sehr un-
terschiedlichen Dynamik der beiden Lipidketten von Cer[NS] ist
ein Haarnadelmodell für Cer unwahrscheinlich. Sowohl für die
fluiden als auch die Sphingosinketten im 2-Seiten-Austausch
wird eine Symmetrieachse entlang seiner Längsachse gefordert.
Da keinerlei Anzeichen für eine solch hohe Dynamik für die
Lignocerylkette in den 2H-NMR-Spektren gefunden wurde, muss
das Haarnadelmodell verworfen werden. Selbst mit einer all-
trans–Konformation der Lignocerylketten würde eine solche ax-
ialsymmetrische Rotationsdiffusion zu einem Ordnungspara-
meter von 0.5 führen, was eindeutig nicht beobachtet wurde.
Daher kann nur eine gestreckte Konformation für Cer[NS] ange-
nommen werden, in der sich beide Ketten unabhängig vonein-
ander bewegen können. Selbst bei erhöhter Temperatur sehen
wir eine sehr unterschiedliche Dynamik der beiden Ketten, die
ein Haarnadelmodell ausschließen. (iii) Um große Packungs-
defekte zwischen den Ketten unterschiedlicher Länge an der
Grenzfläche zwischen orthorhombischen und mobilen Ketten zu
vermeiden, wird es wahrscheinlich, dass das SC eine Domänen-
struktur aufweist. Da mobile und geordnete Ketten sehr unter-
schiedliche Längen aufweisen, würde eine zufällige Verteilung
der Lipide häufig diese hydrophoben Defekte verursachen, was
energetisch sehr ungünstig wäre. Diese Situation wird durch das
Clustern von Lipiden vermieden, wodurch die Grenzfläche zwi-
schen den Domänen hoher und niedriger Kettenlänge minimiert
wird. Solche Fluktuationen der Lipidverteilung entsprechen auch
den modernen Modellen fluider biologischer Membranen.[26;27]
Zusammengefasst kann (iv) mit den neuen Strukturdaten dieser
Studie ein Modell der SPP des SC wie in Abb. 3 skizziert
vorgeschlagen werden. Bei Hauttemperatur liegen die Cer-Mole-
küle in einer gestreckten Konformation vor. Hoch dynamische
und hoch geordnete Ketten sind wahrscheinlich räumlich vonein-
ander getrennt wodurch Heterogenitäten in der Lipidverteilung
entstehen. Bewegliche Lipidketten könnten wichtig für die Haut-
elastitzität und die Permeation physiologisch wichtiger Moleküle
wie Wasser, Zytokine oder antimikrobiotische Peptide sein. Mit
den Daten dieser und zwei kürzlich veröffentlichter Studien,[9;10]
die die hohe Dynamik der Cer-Moleküle beleuchten, erscheint
es notwendig, dass die Modelle der äußeren Hautschichten im
Hinblick auf die hohe molekulare Dynamik einiger Lipide unter
physiologischen Bedingungen überarbeitet werden müssen.
Danksagung
Die Arbeit wurde durch die Tschechische und Deutsche For-
schungsgemeinschaft (19-09135J und HU 720 18/1) sowie das
Projekt EFSA-CDN (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/ 0000841)
des ERDF gefördert. O. E. dankt für Stipendien der Sigrid-Juse-
lius-Foundation sowie der Ruth- und Nils-Erik Stenbäck's Foun-
dation.
Stichwörter: Kettenkonformation • Lipide • Membranen •
Nanostruktur • NMR-Spektroskopie
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Abbildung 3. Modell der SPP einer SC-Mischung aus gleichen molaren
Anteilen von Cer[NS]/LS/Chol bei physiologischer Hauttemperatur.
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Eintrag für das Inhaltsverzeichnis
Dynamische Ketten in einer rigiden Matrix. Obwohl ursprünglich als vollkommen rigide angenommen, zeigen unsere
spektroskopischen Daten, dass die Sphingosinkette der Ceramidmoleküle der äußersten Hautschicht einem komplexen dynamischen
Verhalten unterliegt. Durch diese Ergebnisse muss das Modell der Hautbarriere modifiziert werden.
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