On the active substances of croton oil. VII. Phorbol

Full text of DOI:10.1515/znb-1966-1220

E. HECKER UND ANDERE
1
204
by Mr. H. J o c k u s c h
9
recently in this laboratory. nium sulfate method9,10. About
The aggregation of the native proteins into TMV- nucleoprotein of A-14 applied could be recovered
1
/
1
0
of the total
like rods of varying length was also confirmed in as moderately pure native protein with an E.2§ jE 2m
the electron microscope.
value of
0
.6 6 .
The procedure has been further simplified by
doing away with the dialysis and centrifugation
steps. When TMV suspended in water or in a weak
buffer is led directly into the electrophoresis cham­
ber under otherwise identical conditions mentioned
above, the virus disintegrates into its components
and the products can be collected in the usual way.
A typical run with vulgare is shown in Fig. 3. The
protein fractions recovered satisfied the criteria of
nativity. This simplified method, however, was only
partially applicable to the strain A-14, from which
For many strains of TMV, the free flow electro­
phoresis promises to be the method of choice. It
yields large quantities of native protein in a relati­
vely short time.
My sincere thanks are due to Dr. H. G.
W it t m a n n ,
Director, Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik,
Berlin, for valuable discussions and to the “Deut­
sche Forschungsgemeinschaft” for finan­
cial aid in procuring the apparatus. The able technical
assistance of Miss M o n ik a N eu m a n n and M r . P. H e in ­
it is difficult to obtain pure protein by the ammo- r ic h are also gratefully acknowledged.
9
H.
J
o c k u sc h , Biochem. biophysic. Res. Commun. 24, 577
10 H. G. W it t m a n n , Z. Vererbungslehre 93, 491 [1962].
[
1966].
Uber die Wirkstoffe des Crotonöls, VII
Phorbol
1
E r ic h
h
E c k E r , c h r i s t o p h v . s z c z E p a n s k i ,
h
u g o
k
u b i n y i ,
h
o r s t b r E s c h , E c k h a r t
h ä r l E ,
h
a n s
u
l r i c h s c h a i r E r und
h E l m u t b a r t s c h
Max-Planck-Institut für Biochemie, München, und Biochemisches Institut
am Deutschen Krebsforschungszentrum, Heidelberg
(Z. Naturforschg. 21 b, 1204—1214 [1966]; eingegangen am 19. September 1966)
The preparation of phorbol C20H,8O6 from croton oil and of some functional derivatives is
described. The six oxygen functions of phorbol are identified as five hydroxyl groups and one car-
bonyl group. Two C= C double bonds are part of primary allylalcoholic and a,/?-unsaturated carbo-
nyl groupings. The carbon skeleton contains four rings and the parent hydrocarbon is most pro-
bably of diterpene nature.
Die aus Crotonöl rein dargestellten toxisch, ent­ sä urerest (I). 3 weitere Sauerstoffunktionen wurden
zündlich und cocarcinogen hochaktiven Wirkstoffe als freie Hydroxylgruppen erkannt, von denen eine
Al —A4 und Bl —B7 enthalten
Sauerstoff­ primä r und allylständig ist. Die achte Sauerstoff­
funktionen. 4 davon gehö ren zwei Estergruppen an: funktion ist in einer a,/9-ungesättigten Carbonyl-
die wirksamen Naturstoffe sind Diester und enthal­ gruppe enthalten. Aus allen Wirkstoffen wird durch
ten jeweils einen kurz- und einen langkettigen Fett­ reduktive Esterspaltung mit LiAlH
die kristalline
2
-
4
5
~
7
8
4
1
2
VI. Mitt.: Z. Krebsforsch. 68, 366 [1966].
E.
5 E. h e c k e r , h . k u B in y i u . h . B r e s c h , Angew. Chem. 76, 889
[1964] ; Angew. Chem. Internat. Edit. 3, 747 [1964] ; E.
h
e c k e r , h . B r esc h u . c h . v . s z c z e p a n s k i, Angew. Chem.
7
[
6, 225 [1964] ; Angew. Chem. Internat. Edit. 3, 227
h
e c k e r u . h .
k
u B in y i, Z. Krebsforschg. 67, 176 [1965].
1964]; E.
h
e c k e r u . h . B r e s c h , Z. Naturforschg. 20 b,
6 E.
h
e c k e r , vorgetragen auf dem I. Weltfettkongreß, Ham-
2
16 [1965],
burg 12.—-18. Oktober 1964, Abstracts p. 176; vgl. E.
3
h . k u B in y i u . E.
h
e c k e r , Analytikertagung Lindau 13. bis
h e c k e r , h . B r e sc h u . J. G. m
e y e r , Fette-Seifen-Anstrich-
1
E.
6. April 1966; Z. analyt. Chem. 221, 424 [1966].
mittel 67, 78 [1965].
4
h
e c k e r , 17. Mosbacher Kolloquium „Molekulare Bio-
7 E. c l a r k e u . E.
h
e c k e r , Naturwissenschaften 52, 446
logie des malignen Wachstums“ 21.—23. April 1966,
Springer-Verlag, Berlin-Göttingen-Heidelberg-New York
[1965] ; Z. Krebsforsch. 67, 192 [1965].
1
966, p. 105.
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ÜBER DIE WIRKSTOFFE DES CROTONÖLS VII
1205
Hexahydroxy-Yerbindung C2 0
die Carbonylgruppe des Enonsystems unter Auf­ von Bariumhydroxyd behandelt. Man erhält Phor­
nahme von
Wasserstoffatomen reduziert ist. Ge­ bol aus äthanolischer Mutterlauge als farblose,
meinsamer Grundkö rper ist daher eine Verbindung lösungsmittelhaltige Kristalle, die unter Ä thanol in
(II), die als das zuerst von Flaschen- der Kälte aufbewahrt längere Zeit haltbar sind. Die
t r ä g e r beschriebene „Phorbol“ erkannt wurde2“7. Ausbeute an „Alkoholphorbol“ beträ gt im Mittel
H3 0
O6
erhalten, in der Schriften 10, 1 4 mit einer methanolischen Lösung
2
C2 0
H2 8
O6
etwa 1 Gew.-% des eingesetzten Crotonöls. Sie liegt
I
i ch2oh
c= c -
damit in derselben Grö ß enordnung, in der die Wirk­
stoff-Fraktionen A und B im systematischen Tren­
nungsgang aus Crotonöl isoliert werden15.
Alkoholphorbol ist in Wasser bei Raumtempera­
tur zu 17 Gew.-% löslich. Erwä rmt man die kalt ge­
-
l
»
-
-
-
-
C -O -C -R ,
I
I
o
il
c- o - c- r2
I
C - 0 H
sättigte Lösung auf 60°, so bleiben nur
in Lösung —der Rest fällt als Lösungsmittel-freies
Wasserphorbol“ * aus, das im Gegensatz zu Alko­
6
—8 Gew.-%
I
I
C -O H
„
I
I
I
holphorbol unverä ndert haltbar ist. Zur weiteren
Reinigung muß aus wä ß riger Lösung gewonnenes
Phorbol wieder aus Alkohol kristallisiert werden16.
Phorbol ist sowohl sauerstoff- als auch säure- und
-
c=c-c=o
I: R j b z w . R „ : k u r z - b z w . l a n g k e t ti g e F e t ts ä u r e r e s t e ,
j = 2 = H
II:
R
R
.
Kristallines Phorbol wurde bereits in den 20er Jah- alkaliempfindlich. Wird die Substanz mit 2-n. metha­
ren aus Crotonöl durch alkalikatalysierte Methanolyse
dargestellt8’ 9. Flaschenträger und Mitarb. haben die
Bruttoformel C2oH28_3006ermittelt10, u . Im Toxizitäts-
test an Fröschen2’ 0,8’9,12 und Kaninchen8,9 ist Phor-
nolischer KOH erwä rmt und dann neutralisiert, so
erhält man mit FeCl
3
eine deutliche Phenol- bzw.
Enolreaktion. Die reduzierende Wirkung gegenüber
bol — im Gegensatz zu Crotonöl — unwirksam. Da Tollens-Reagenz, Fehlingscher Lösung sowie
sich jedoch ein acetyliertes Phorbol als toxisch erwies, Tillmanns Reagenz
1
0
,
1 4 konnte bestätigt werden.
vermuteten bereits Böhm und Flaschenträger eine Be-
Die Charakterisierung von Phorbol und seinen
ist durch die Neigung der Substanzen,
Lösungsmittel einzuschließen, auß erordentlich er­
ziehung zwischen Phorbol und den natürlichen Wirk-
stoffen des Crotonöls 8>9.
Estern -■
5 - 7
Wir konnten das wirksame Acetylphorbol als Tri­
acetat identifizieren2 > 6 und seine — im Vergleich
schwert. Alkoholphorbol, das nach KMR-Daten
1
Mol Ä thanol enthält, liefert z.B. Schmelzpunkte,
die bei verschiedenen Prä paraten zwischen 230 und
40° liegen, jedoch scharf innerhalb eines Tempe-
raturintervalles von ° schmelzen.
zum Wirkstoff Al jedoch geringe — Toxizität an
Fröschen bestätigen. Außerdem wurde von uns auch
eine schwache entzündliche und cocarcinogene Akti­
vität des Triacetates an der Maus nachgewiesen 2> 6.
Mit der Partialsynthese einiger natü rlicher Wirk­
stoffe des Crotonöls gelang kürzlich der endgültige
Beweis, daß Phorbol der Grundkö rper der Wirk­
stoffe ist13.
2
2
Das Ergebnis der Elem entaranalyse von Phorbol
(
Ultramikromethode nach Walisch 17) läßt sich am
besten mit der Bruttoformel C2 0 vereinbaren.
Die Bestimmung des Mol.-Gew. gelingt mit der scho­
H
2 8
O6
nenden Methode der Elektronenanlagerungs-M assen
-
spektrom etrie nach v. Ardenne 1 8 (Abb. 1). Neben
dem Molekülion [m /e 364) treten — ähnlich wie
Darstellung und Charakterisierung von Phorbol
Zur Darstellung von Phorbol wird Crotonöl in bei den Wirkstoffen
2
,
7
— Fragmente auf, die sich
Anlehnung an die in der Literatur angegebenen Vor- durch die Abspaltungvoneinem, zwei und drei Mole-
8
B .
B
F
l a s c H e n t R ä g e R , A n g e w . C h e m . 43, 1011 [1930]; R .
*
I m f o lg e n d e n a ls P h o r b o l b e z e ic h n e t.
ö H m u . B . l a s c H e n t R ä g e R , A rc h . e x p . P a t h o l . P h a r m a k o l .
F
12 e .
H
e c k e R , Z. K r e b s f o r s c h . 65, 3 2 5 [ 1 9 6 3 ] .
e c k e R , H . ü B in y i, H . u . s c H a iR e R , c H . v . s z c z e p a n s k i
R e s c H , A n g e w . C h e m . 7 7 , 1 0 7 6 [ 1 9 6 5 ] A n g e w .
C h e m . i n t e r n a t . E d i t . 4 , 1 0 7 2 [ 1 9 6 5 ] .
H . a u FFm a n n u . H . e u m a n n , C h e m . B e r . 9 2 , 1 7 1 5 [ 1 9 5 9 ] .
15 e . e c k e R , H . R a c H ­
a R c z y k , J. G. m e y e R , H . B R e sc H u . i .
1
57,115 [1930].
13 e .
H
k
9
R . B ö h m , B . F l a s c h e n t r ä g e r u . L . L e n d l e , A r c h . e x p .
u . H .
B
;
P a t h o l . P h a r m a k o l . 177, 212 [1935].
1
0 B.
F
l a s c H e n t R ä g e R , Z A N G G E R -F estschrift, Z ü r ic h 1934, Bd.
14
t
k
n
II, S. 857.
H
j
B
11 B. F l a s c h e n t r ä g e r u . G.
W
ig n e r , H e lv . c h im . A c ta 25, 569
m a n n , Z. K r e b s f o r s c h . 6 6 , 4 7 8 [ 1 9 6 5 ] .
[
1942].
16 e . B a u m H e ie R , D i s s e r t a t i o n , U n iv . L e ip z i g 1 9 3 2 .
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1
206
E. HECKER UND ANDERE
Abb. 1. Elektronenanlagerungs-
Massenspektrum von Phorbol;
Verdampfertemperatur 130°.
2
60
300
320
Massenzahl
-
külen Wasser aus dem Molekularion ableiten. Was­
serabspaltungen finden sich auch in den Elektronen-
stoß-Massenspektren; es gelang jedoch mit dieser
Methode auch unter schonenden Meßbedingungen
nicht, ein Molekülion zu beobachten; das Ion grö ß er
Masse fand sich bei m /e =346*. Audi in den Elek-
tronenstoß spektren sind die Massenzahlen m/e=328
(
M —2 H
2
0) und m/e=310 (M —3 H
ders intensiv vertreten; ferner scheint die Abspal­
tung von 28 Masseneinheiten (328 —> 300 oder
10->282) der nächste Fragmentierungsschritt zu
sein.
2
0) beson­
3
Die Ergebnisse der Analysen von F l a s c h e n t r ä g e r
C2oH2 8 _ 300 6) kommen der von uns erstmals2 ’
(
8
mit
physikalischen Methoden bestimmten Bruttoformel des
Phorbols (C2oH280 6) am nächsten. T h o m a s und M a r -
x e r 1 9 hatten demgegenüber C1 9
angenommen. A r r o y o und H o l -
H2 6
0 6 , K a u ffm a n n und
N e u m a n n 1 4
C1 9
H2 8
0
6
com b 2 0 > 2 1 beschreiben die Darstellung von Phorbol
durch Alkoholyse eines Cocarcinogens C-3 und gelan­
gen auch zur richtigen Bruttozusammensetzung
X [m fi] ■
Abb. 2. UV-Spektren des Phorbols in Äthanol (4------b) und
Dioxan (o —O).
C2 0
H2 8
O . V a n D u u r e n und und O r r is 22, die Phorbol
6
durch Alkoholyse von Crotonharz erhielten, haben die
kürzlich bestätigt.
Formel C2 0
H2 8
O6
Phorbol zeigt in Ä thanol und Dioxan die in ser a,^-ungesä ttigten Carbonylgruppe anzusprechen.
Abb.
wiedergegebenen U V-Spektren. Die Absorp­ Geht man zu Dioxan als weniger polarem Lö sungs­
mittel ü ber, so tritt eine weitere Absorption bei
2
tion bei 196 m/jl (in Ä thanol) ist einer isolierten
C=C-Doppelbindung zuzuordnen23. Das Maximum
bei 235 m u entspricht dem >■ *-Ü bergang eines
249 m/f etwas deutlicher hervor.
D ie circulardichroitische A bsorption der n—> n * -
n
a,^-ungesä ttigten Ketons, die Bande bei 335 m/x ist und 7i—> ;r*-Banden des Phorbols zeigen entgegen­
nach Lage und Intensität als n-> *-Ü bergang die- gesetztes Vorzeichen (Abb. 3). Interessant ist eine
n
*
Dieser Befund ist zuerst Massenspektren von Phorbol ent-
nommen worden, die wir Herrn Prof. Dr. G. s p it e l l e B ver-
19 A. F.
t
H o m a s u . A.
m
a R x e R , Experientia [Basel] 14, 320
[1958].
danken und wurde von uns reproduziert.
20 E. a R Ro y o u. J. H o lc o m B , Chem. and Ind. 1965, 350.
1
1
7 W. W a l is c H , Chem. Ber. 94, 2314 [1961].
8 M. v.
B e R , Experientia [Basel] 19,178 [1963].
21 E. a R R o y o u . J. H o lc o m B , J. med. Chem. 8, 672 [1965].
22 B. L. v a n u u R e n u . L. o R R is , Cancer Res. 25,1871 [1965].
a
R d e n n e , K. s t e in F e l d e R , R. T ü m m le r u . K. s c H R e i­
d
23 J. H . c H a pm a n u . a . c .
p
a R k e R , J. chem. Soc. [London]
1
961, 2075.
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ÜBER DIE WIRKSTOFFE DES CROTONÖLS VII
1207
Multi-
plizi-
tät*
Inten-
<5 in ppm
<5 in ppm
Signal
J (Hz)
sität (d5-Py/D20) (d6DMSO)
IjI = 1,
1
A
1
7,88
7,52
M
\
J 2 = 1
1
1
B
C
1
1
6,17
5,03
5,44
3,83
D
D
J = 6
J = 11
W i = 6,
^2 -
1
D
1
3,93
2,91
T
1
6
fJi = 1,
1
E
1
3,71
2,91
T
l J 2 - 2
_
**
\J i = 11,
1
1
F
1
1
2,79
1,34
M
D
\
J t = 7
G
0,52
J
=
6
m /i—
2 A
2
2
4,29
3,10
3,77
2,32
S
S
--
—
2
B
Abb. 3. Circulardichroitische Absorption des Phorbols im Be-
reich von 250—400 mju in Dioxan.
3
A
3
1,70
1,67
M
3
3
3
B
C
3
3
3
ca. 1,6
ca. 1,7
ca. 1,7
1,15
1,04
0,88
S
S
—
—
= 1
—
—
weitere dichroitische Absorption bei 270 m ju. Das
UV-Spektrum zeigt an dieser Stelle keine Bande.
Im IR -Spektrum sind fü r C=0- und C=C-Va-
lenzschwingungen a,^-ungesä ttigter Carbonylsysteme
charakteristische Banden zu erkennen.
D
D
J
OH
OH
1
4
—
—
5,44
4 ,1 -4 ,2
—
—
Tab. 1. KMR-Daten von Phorbol in d5-Pyridin/D20 und d6-
Dimethylsulfoxyd. * S = Singulett, D = Dublett, T = Tri-
plett, M = Multiplett. **Nicht zuzuordnen.
K M R -Spektren des Phorbols können in d
5
-Pyri-
din/D20 (Abb. 4) und in d6-Dimethylsulfoxyd (d6-
DMSO) gemessen werden (Tab. I)24. In diesen
Spektren sind 7 CH-Gruppen (1A-G), 2 CH -Grup-
pen (2A, B), 4 CH3-Gruppen (3 A-D) und 5 OH-
IA um 1,8 ppm nach höherem Feld. Signal
dem /3-Proton einer Allylalkoholgruppierung zugeord­
net werden: Oxydation der Allylalkoholgruppierung
zum a,/5-ungesättigten Aldehyd2-5> verschiebt 1B um
1
B kann
2
Gruppen zu erkennen.
7
Abb. 4. KMR-Spektrum von
Phorbol in d5-Pyridin/D20 (100
MHz, TMS 0,00 ppm).
3A.B.C.D
_
l_________________ I_ __________
L
______
1_ __
I
__
I
______
I_ _
I
___________I
I_ _____
7
,88
6.17
5,03
4,29 3,933,71
3,10 2,79
1,70 1.34 ppm
Die Signale 1 C bzw. 2 A (Tab. 1) lassen sich Pro­ 1ppmnadi niedrigerem Feld. Gleichzeitig erscheint ein
tonen zuordnen, die geminal zu einer sekundären bzw. Singulett bei 9,4 ppm (Aldehydproton), die a-Stellung
primären Hydroxylgruppe stehen; nach Veresterung dazu ist also substituiert.
des Phorbols erscheinen sie bei niedrigerem Feld. Die
Signal G kann einem Proton an einem Cyclopro-
1
restlichen drei Hydroxylgruppen des Phorbols müssen panring zugeordnet werden, da es in de-DMSO bei
tertiär sein, da bei Veresterung keine zusätzlichen Ver­ 0,52 ppm liegt (vgl. Tab. 1 und weiter unten).
schiebungen zu beobachten sind. A und 1B können 3 A entspricht einer Methylgruppe an einer Doppel­
als Signale von Protonen an Doppelbindungen identifi­ bindung. Nach der Lage des Signals imPhorbol-triace-
ziert werden; die Lage von A spricht für ein ^-Pro­ tat (Tab. 3) ist a-Stellung an einem a,/?-ungesättigten
ton an einem ,^-ungesättigten Carbonylsystem. Re­ Carbonylsystem anzunehmen. Reduktion der Carbonyl­
1
1
a
duktion der Carbonylgruppe zum sekundären Alkohol, gruppe verschiebt 3 A um etwa 0,1 ppm nach höherem
der Hexahydroxy-Verbindung Phorbolol
5
-
7
verschiebt Feld. 3 B und 3 C lassen ich im Phorbol-triacetat als
24 E. H e c k e r , H . K u b in y i, Ch. V. S z c z e p a n s k i, E.
H
ä r l e u . H . B r e s c h , Tetrahedron Letters [London] 1965, 1837.
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1
208
E. HECKER UND ANDERE
Signale von Methylgruppen an vollständig substituier­
ten Kohlenstoffatomen identifizieren. 3 D ist einer wei­
teren Methylgruppe zuzuordnen; das Signal liegt als
Tri- und Penta-ester des Phorbols
Phorbol läßt sich mit einem Ü berschuß von Acet-
Dublett vor (Tab. ). Am a-ständigen C-Atom muß
1
anhydrid in Pyridin zu einem Triacetat2 ’
6
U ­
setzen. Die Substanz schließt leicht Lösungsmittel
ein: aus CC1 umkristallisierte Proben enthalten
nach Trocknen im Hochvakuum bei 80° noch etwa
Mol CC1 (Halogenbestimmung). Petrolä ther
also noch ein Proton stehen.
4
ent-
koppelte
Auf-
spaltung
in Hz
eingestrahlt beobachtet
bei
bei
Änderung der
M ultiplizität *
1
4
[
ppm]
[ppm]
wird weniger hartnäckig eingeschlossen, auch Benzol
läßt sich am Hochvakuum weitgehend entfernen.
Aus Benzol/Petroläther umkristallisiertes und im
Hochvakuum bei 80° zur Gewichtskonstanz getrock­
netes Phorbol-triacetat enthielt nach KMR-Messun-
gen noch 1,3% Benzol. Korrigiert man dieAnalysen­
werte der Substanz entsprechend ihrem Lösungsmit­
telgehalt, so erhält man die fü r Phorbol-triacetat
3
IE
1
IB
IG
A
1,701
3,71/
3,93
6,17
1.34
1
A
7,88 M - ^ S
D
IB 6,17
ID 3,93
ID 3,93
D - >S
T -* D (J = 6)
T
D (J = 6)
1
3
3
1
A
7,881
IE 3,71
T -> S
A
1,70J
D ca. 1,6
3,93
1F 2,79 M -> D (J = 11)
1G 1.34
D ->S
D
C
2 6
H3 4
0
9
z u erwartenden Werte. Schmelzpunkts­
bestimmungen an Triacetat führen zu ähnlich unbe­
Tab. 2. Doppel- und Tripelresonanzmessung von Phorbol in
d5-Pyridin/D;>0. * S = Singulett, D = Dublett, T = Triplett, friedigenden Ergebnissen wie bei Phorbol: die Prä ­
M = Multiplett.
parate schmelzen zwischen 110 und 130°, jedoch
scharf innerhalb von 2 °.
Durch Doppel- und Tripelresonanzmessungen
Tab. ) können zusätzliche Aussagen ü ber die
Elektronenanlagerungs - M assenspektrom etrie des
Phorbol-triacetates liefert das zu erwartende Mol.-
Gew7. 490, während im Elektronenstoß-Massenspek-
trum als höchste Masse m/e=430 gefunden wurde.
Die wichtigsten Massenspitzen lassen sich durch die
Abspaltung von insgesamt 3 Moll. Essigsäure und
Mol. Wasser deuten.
Das UV-Spektrum des Phorbol-triacetates in
Ä thanol zeigt Banden bei 194 —200 m« (s 12000),
32 mju (s 5200) und 334 m/t (£ 70). In Dioxan
erhält man —ähnlich wie bei Phorbol —zusätzlich
(
2
Strukturelemente des Phorbols gemacht werden. Die
Methylgruppe 3 A zeigt eine longrange-Kopplung
mit dem Doppelbindungsproton IA; IA koppelt
mit dem Proton 1 E einer benachbarten —CH-
Gruppe, ebenso zeigen die Wasserstoffe der Methyl­
gruppe 3 Aeine homoallylische longrange-Kopplung
mit 1 E, wie sie fü r das Strukturelement III bereits
ausführlich in der Literatur beschrieben wurde23.
1
2
Das Doppelbindungsproton
Proton D, dem Wasserstoff einer —CH-Gruppe.
Dkoppelt selbst wieder mit dem Proton am Cyclo-
propanring G, so daß sich Teilstruktur IV ergibt.
1
B koppelt mit dem
1
eine Bande bei 248 m ;a (e 5000).
1
1
Um auszuschließen, daß es sich dabei um die Ab­
Proton 1 F, ebenfalls der Wasserstoff einer —CH- sorption einer Verunreinigung handelt, wurden 5 Pro­
ben Triacetat unterschiedlichen Reinigungsoperationen
unterworfen (Cr ai g-Verteilung, Umkristallisieren
aus verschiedenen Lösungsmitteln) und danach die
Spektren gemessen. Mögliche Verunreinigungen sollten
C, in den einzelnen Präparaten in verschiedenen Konzen­
Gruppe, koppelt mit den Wasserstoffen der Methyl­
gruppe 3 D. Nach Entkopplung tritt fü r 1 F ein
Dublett mit der Kopplungskonstante 7=11 Hz auf.
Eine identische Kopplungskonstante fü r Signal
1
dem Wasserstoff geminal zur sekundä ren Hydroxyl­ trationen vorliegen und das Verhältnis der Extinktio­
nen E230/E 24S beeinflussen. Tatsächlich wird aber ein
konstanter Wert von gefunden.
gruppe, zeigt, daß 1 C neben 1 F stehen muß , Teil­
formel V.
1
, 1
ImK M R-Spektrum des Phorbol-triacetats (Tab. 3)
H
H
sind 3 Acetylgruppen (um 2,1 ppm) erkennbar.
Hydroxylgruppen (2,92 und 5,50 ppm) lassen
H,C
2
-
H
CH3
OH
sich mit D20 austauschen. Phorbol enthält somit 3
mit Pyridin/Acetanhydrid veresterbare und 2 unter
diesen Bedingungen nicht veresterbare Hydroxyl­
gruppen. Diese Hydroxylgruppen des Triacetats
lassen sich jedoch mit Acetanhydrid/p-Toluolsulfon-
N
F
2
3 N. S. B H acca and D. H. W il l ia m s , Applications of NMR
spectroscopy in Organic Chemistry, Holden Day Inc., Lon-
don 1964, S .110 ff.
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ÜBER DIE WIRKSTOFFE DES CROTONÖLS VII
1209
reduktive Spaltung der isolierten Wirkstoffe erhal­
tenen Phorbolol-Prä paraten 2’ identisch.
Die katalytische Hydrierung von Phorbol-triace­
tat mit Palladium-Tierkohle bei Atmosphärendrude
und Raumtemperatur liefert ein Hauptprodukt, das
Inten-
sität
Multipli-
zität *
Signal
<5 in ppm
J
[Hz]
**
5
- 7
9
1
A
1
1
1
1
1
7,59
5,72
5,40
3 .2-3,3
3 .2-3,3
M
D
D
?
IB
5 - 6
11
1
C
ID
9
mitKMn0 oder Brom nicht mehr reagiert. Das UV-
Spektrum (in Methanol) zeigt Banden bei 194 mju
4
IE
9
?
i p * * *
2
2
A
B
2
2
4,48
2,50
s
s
—
(e
2
2
0
0
) und 308 m/< (f 40). Die Substanz kann
danach keine C=C-Doppelbindungen mehr enthal­
ten, die Absorption der Carbonylbande ist gegen­
ü ber Phorboltriacetat um 24 m/t hypsochrom ver­
schoben. Im K M R -Spektrum treten die den Protonen
fJ i = 1 -2 ,
1 - 2
3
A
3
1,78
Q
s
D
\
J
2
3
3
B
D
6
3
1,27
0,91
7
1
A und 1 B des Ausgangsmaterials entsprechenden
Acetyl-
gruppen
OH
9
2,05-2,10
3S
Signale im Bereich der olefinischen Protonen nicht
mehr auf. Das Signal der CH2-Gruppe des primä ­
ren Alkohols (2 A in Phorbol) ist im Bereich ober­
halb 2,5 ppm nicht mehr aufzufinden; die Substanz
kann also in dieser Position keine Estergruppierung
mehr enthalten. In Ü bereinstimmung damit liegen
1
1
5,50
2,78
-
OH
Tab. 3. KMR-Daten von Phorbol-triacetat in CDC13. * Q =
Quadruplett. ** Nicht auflösbare Signale sind in den Spalten
Multiplizität“ und „J [Hz]“ mit Fragezeichen versehen.
** Nicht zuzuordnen.
„
*
im Hydrierungsprodukt nur noch
2,07 und 2,09 ppm) vor. Um 0,8 —1,3 ppm treten
ca. 15 Protonen auf; das Signal 1 G erscheint bei
,7 ppm (Dublett, / = Hz, Cyclopropanproton).
2
Acetylgruppen
(
sä ure verestern und man erhält ein Phorbol-penta-
acetat. —Mit Benzoylchlorid in Pyridin lä ß t sich
Phorbol zueinem Tribenzoat vomSchmp. 213 —215°
umsetzen.
Phorbol-triacetat gibt unter energischen Bedin­
gungen ein 2.4-Dinitrophenylhydrazon in mäß iger
0
6
Die Elektronenstoß-M assenspektrom etrie liefert m je
=
376 als schwerstes Ion. Da die Substanz nach
KMR ein Diacetat ist und die Acetylgruppe am
C-Atom des ehemaligen Allylalkohols nicht mehr
enthält, ist das Hydrierungsprodukt als Desoxy-
tetrahydrophorbol-diacetat zu deuten. Es entsteht
Ausbeute. Damit sind alle
Phorbols auf chemischemWege bestätigt.
6
Sauerstoffatome des
F l a s c h e n t r ä g e r 9’ 10 beschreibt das oben erwähnte aus Phorbol-triacetat unter hydrogenolytischer Ab­
toxische Acetylphorbol vom Schmp. 119° als Tetra-
spaltung von Essigsä ure aus der Allylestergruppie-
rung und Absä ttigung zweier C=C-Doppelbindun­
gen. Wie im Fall des Triacetates konnte mit der
Elektronenstoß -Massenspektrometrie nur M-60 als
acetat, Kauffmann und neumann 14 beziehen auf
C
1 9
H
2 8
0 und nehmen ein Triacetat an. arroyo und
6
Holcomb 20’ 21 sowie v a n Duuren und orris 22 haben
kürzlich ebenfalls über ein Phorbol-triacetat berichtet,
arroyo und Holcomb 21 beschreiben außerdem ein Ion höchster Masse gefunden werden.
Phorbol-tetraacetat. baumHeier 16 berichtet über ein Di-
acetat des Phorbols. THomas und marxer 19 disku-
Schon Paal und roTH 26 haben gefunden, daß Cro-
tieren 2 Monoacetate und ein Diacetat: Diese Autoren
tonharz durch Hydrierung mit kolloidalem Platin und
Wasserstoff den scharfen Geschmack und die giftige
Wirkung vollständig verliert. flascHenTräger 10 ver-
gehen von
C1 9
H2 6
06 aus, bezogen auf die richtige Brutto-
formel C20H28O6 für Phorbol würden ihre Analysen
auch auf Phorboltriacetat und 2 Diacetate stimmen. —
Ein Dibenzoat wurde von flascHenTräger 10 beschrie-
ben. Kauffmann und neumann 14 deuteten diese Verbin-
dung auf Grund ihrer Analysendaten als Tribenzoat.
mutete im Phorbol
3 C = C-Doppelbindungen (Jod-
zahl) . Bei der Hydrierung mit Platin erhielt er kein ein-
heitliches Produkt. Nach Kauffmann und neumann 14
nimmt ein Mol Phorbol mit Platin als Katalysator
unter reduktiver Abspaltung einer Hydroxylgruppe
Reduktion von Phorbol-triacetat mit LiAlH er­ langsam 3 Mole Wasserstoff auf, ohne daß die Carbonyl-
4
gibt unter Abspaltung der Esterfunktionen und Auf­ gruppe angegriffen wird. Van Duuren, arroyo und
O r r is 27 beobachteten die Bildung einer phenolischen
Substanz vom Schmp. 96° bei der katalytischen Hy-
drierung eines nicht näher charakterisierten Gemisches
nahme von 2 H-Atomen Phorbol-ol, das bereits von
K
a u f m a n n und
n
e u m a n n 1 4 auf analogem Wege aus
Phorbol-tribenzoat erhalten wurde. Phorbolol wird
als Tetraacetat charakterisiert und zeigt um 230 mju
keine UV-Absorption mehr. Es ist mit den durch
2
6 C. p a a l u . K. R o t H , Ber. dt. chem. Ges. 42, 1541 [1909].
2
7 B. L. v a n
d
u u R e n , E.
a
R R o y o u . L. o R R is , J. med. Chem.
6
, 616 [1963].
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1
210
E. HECKER UND ANDERE
cocarcinogener Substanzen aus Crotonöl. Später erhiel­ vom Verhalten gewöhnlicher tertiä rer Hydroxyl­
ten a rroyo und H olcom b 2 0 bei der katalytischen Hy­
gruppen abweicht.
drierung des Cocarcinogens C-3 ein Gemisch von Hy­
Die a,ß-ungesättigte Carbonylgruppe (f) ist im
drierungsprodukten, aus dem sie eine kristalline Sub­
Phorbol mit den üblichen Carbonylreagenzien nicht
stanz (Schmp. 101 —102°) mit einem Mol.-Gew. von
M=604 (massenspektrometrisch) isolierten. Nach den nachweisbar 2> 5_7j 10, 28. Von Phorbol-triacetat läßt
UV-Daten der Autoren ist darin die a,/?-ungesättigte
Carbonylgruppe offenbar noch enthalten.
sich jedoch ein 2.4-Dinitrophenylhydrazon erhalten.
Strukturelement X enthält ferner die nach KMR
Daten a-ständige Methylgruppe. Werden die Wirk­
stoffe, Phorbol-triacetat oder Phorbol-tribenzoat re­
duktiv gespalten, so entsteht aus der Carbonylfunk-
Strukturelemente und Partialstrukturen
des Phorbols
Mit den an Phorbol und den beschriebenen Deri­ tion eine sekundäre Hydroxylgruppe, die sich mit
vaten gewonnenen Befunden sind alle Sauerstoff­ Pyridin/Acetanhydrid verestern läßt: man erhält
funktionen * und die beiden C= C-Doppelbindun- Phorbol- (f) -ol-(a,b,c,f) -tetraacetat.
gen festgelegt.
a r x e r 1 9 sowie
6
f l a s c H e n T r ä g e r 10, T H o m a s und
m
K a u f f m a n n et al
.
1
4
,
2 9 konnten nicht alle Sauerstoff­
-
c h =c - c h 2 o h
(O)
ET
-C H -C H 3
n
funktionen des Phorbols zuordnen.
|
I
Neben den Sauerstoffunktionen ergeben sich aus
den KMR-Spektren weiterhin die Strukturelemente
XI —XV. Sie enthalten zusammen mit den Struktur­
elementen VI —X alle H- und O-Atome des Phor­
bols. Ein Teil davon, nämlich X und XIV, VI, XIV
und XV, sowie VII und XI lassen sich auf Grund
der Ergebnisse der Doppelresonanzmessungen (For­
meln III —V) zu den Partialstrukturen XVI —XVIII
erweitern. Aus diesen Partialstrukturen und den
restlichen Strukturelementen VIII, IX, XII und XIII
muß sich die Strukturformel des Phorbols ergeben.
—
CHOH
(b)
VE
2
- c- c h 3
H
1
-
C -O H
(c )
VW
c h 2
1
777T
I
2
-C -O H
( d , e )
R
1
2
-C H
1
77V
ZF
I
c h 3
-
C H = C -C = 0
( f )
V "
Die prim äre H ydroxylgruppe (a, vgl. Formel­
schema) , die in den Wirkstoffen des Crotonöls frei
vorliegt, ist die OH-Gruppe eines primä ren Allyl­
alkohols, der mit aktiviertem Mn0
oxydiert werden kann. Diese Hydroxylgruppe ist in
den natürlichen Wirkstoffen und im Phorbol acylier-
bar und kann —frei 1 4 oder verestert —in be­
2
zum Aldehyd
c h 2o h
(o)
H
H
1
0 ,
h 3 c
kannter Reaktion hydrogenolytisch abgespalten wer­
den: aus Phorbol-(a,b,c)-triacetat entsteht (a)-Des-
oxy-tetrahydro-phorbol-(b,c)-diacetat. Wie aus KMR-
Daten hervorgeht, ist das zur allylisdien CH2-Gruppe
a-ständige C-Atom vollständig substituiert; /instän­
dig ist jedoch ein Wasserstoff vorhanden (Struktur­
element VI).
Unter Pyridinkatalyse lassen sich zw ei w eitere
H ydroxylgruppen b (VII) und c (VIII) verestern,
die auch in den Wirkstoffen verestert vorliegen.
CH3
OH (b)
(
f)
O
jvt
Tvrr
Keine der beiden von rroyo und H olcomb 20, 2 1 vor­
a
geschlagenen Strukturen für den Grundalkohol eines
von ihnen isolierten wirksamen Prinzips aus Crotonöl
ist mit den Daten der hier beschriebenen Teilstrukturen
vereinbar30. — Durch Verknüpfung der abgeleiteten
Strukturelemente und Partialstrukturen auf Grund
weiterer chemischer und spektroskopischer Befunde so­
wie den früher von anderen Autoren14, 2 9 veröffentlich­
ten Ergebnissen von Bleitetraacetat-Spaltungen haben
Nach Aussage der KMR-Spektren ist (b) sekundä r wir eine vorläufige Strukturformel für Phorbol vorge­
und (c) tertiä r. Die beiden restlichen Hydroxyl­ schlagen24. Inzwischen wurde die oxydative Spaltung
an geeigneten Phorbol-Derivaten von uns überprüft 3*4.
gruppen d und e (IX) können nur unter Sä urekata­
lyse acetyliert werden und sind tertiä r. Die Acylier-
Das Ergebnis dieser Ü berprüfung sowie neue chemische
Befunde und circulardichroitische Messungen zeigen,
barkeit der tertiä ren Hydroxylgruppe (c) mit Acet-
daß diese Verknüpfung der Strukturelemente und
anhydrid/Pyridin ist bemerkenswert, da sie darin Partialstrukturen des Phorbols zu revidieren ist 3> 4.
*
Um die Hydroxylgruppen und die Carbonylgruppen unab-
hängig von der Struktur des Kohlenstoffskelettes diskutie-
ren zu können, werden im folgenden kleine Buchstaben
28 F . Frh. v.
29 T h .
F a l k e n H a u s e n , Z. analyt. Chem. 99, 241 [1934].
k
a u F F m a n n , A. e is in g e R , W. j a sc H in g u. k . l e n H a R d t ,
Chem. Ber. 92,1727 [1959].
(
a—f) verwendet. Die Strukturelemente des Phorbols er-
30 E. H ecKer, H . K ubinyi, H . b rescH u . cH . V . s zczePansKi, J.
med. Chem. 9, 246 [1966].
halten römische Ziffern.
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ÜBER DIE WIRKSTOFFE DES CROTONÖLS VII
1211
Entsprechend der Zahl und Natur der Sauerstoff­
funktionen und der Zahl der C= C-Doppelbindun-
gen liegt demKohlenstoffskelett desPhorbols der ge­
Tillmanns Reagenz: 0,05%
2
.
6
-Dichlorphenol-
indophenol-Natriumin 50-proz. Ä thanol. Phorbol wirkt
in n/100 NaOHreduzierend.
sättigte Kohlenwasserstoff C
Tiglian * genannte wurde 2’6. Dem Defizit von
Atomen entsprechend muß Tiglian 4 Kohlenstoff­
2
oH3 4 zugrunde, der
Dü nnschichtchromatographie
Wenn nicht anders vermerkt, gelten 7?/-Werte für
Dünnschichtplatten, die bei Kammersättigung entwik-
8
H-
ringe enthalten. Phorbol, ein Pentahydroxytiglia- kelt werden. Hierzu wird ein Filtrierpapier geeigneter
Größe in die Kammer gestellt. Zur Herstellung der
Dünnschichtplatten werden 29 g Kieselgel Gnach Stahl
der Fa. E. Merck und g Leuchtstoff ZSSuper der
Fa. Riedel de Haen mit 60 ml Wasser angerührt und
mit dem Streichgerät der Fa. Desaga auf Glasplatten
dien-onist vermutlich ein Diterpen.
1
6
Beschreibung der Versuche
Elementaranalysen sind in den Laboratorien der
Union Carbide European Research Associates, Brüssel
und bei F. und E. P a s c H e r , Bonn, ausgeführt worden.
Die Substanzen werden vor der Analyse im Hoch­
vakuum bei 80° bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Schmelzpunkte werden an getrockneten Substanzen auf
dem Mikroskop-Heiztisch 350 der Fa. Leitz bestimmt
und sind unkorrigiert.
(
20*20 cm) gestrichen. Nach kurzem Vortrocknen an
der Luft werden die Platten 1 Stde. bei ° getrock­
aufbewahrt. Die entwickel­
1
1 0
net und später über CaCl
2
ten Platten werden im Licht einer Quecksilberdampf­
lampe betrachtet.
Phorbol (Pentahydroxy-tigliadienon)
5
00 g Crotonöl (DAB
nol in einer 5-Z-Flasche 3 Stdn. unter Stickstoff ge­
schüttelt. Danach werden 55 g Bariumhydroxyd
Ba(OH 0) —in Methanol unter schwachem
6
) werden mit 1,251 Metha­
UV-Spektren Lösungsmittel-freier Substanzen wer­
den mit den Beckman-Spektralphotometern DK2 und
DK2 a „far UV“ aufgenommen. Bei Absorptionen
unterhalb von 220 m^a werden 0,1-cm-Küvetten verwen­
det und das Gerät mit Stickstoff gespült. —IR-Spek-
tren sind mit den Perkin-Elmer-Spektraphotometern 21
und 521 gemessen. —Circulardichroitische Messungen
sind am Circulardichrograph der Universität Bonn aus­
geführt. — Zur Bestimmung der optischen Drehung
getrockneter Substanzen dient ein lichtelektrisches Po­
larimeter der Fa. Carl Zeiss Type I. Es wird in 0,2-
und 0,5-dm-Rohren bei 546,1 und 577,8 mfj, gemessen
und auf die D-Linie umgerechnet. —KMR-Spektren
werden mit den Geräten A60 und HR100 der Fa.
Varian Associates aufgenommen. Als innerer Standard
(
)
2
'
8
H2
1
l
Erwärmen gelöst und filtriert — zugesetzt. Es wird
nochmals 15 Stdn. unter Stickstoff geschüttelt, dabei ist
in der Flasche kein Druckanstieg zu beobachten. Von
den entstandenen Bariumseifen filtriert man ab; das
hellgelbe Filtrat wird am Rotationsverdampfer (Büchi)
bei 50 —60° Badtemperatur eingeengt, bis kein Lö­
sungsmittel mehr übergeht und sich Blasen bilden. Den
Rückstand nimmt man in l Wasser und 400 ml Ä ther
2
auf. Nach kräftigem Schütteln haben sich auch die
dunkelbraunen Schmieren gelöst. Die Trennung der
Phasen macht gelegentlich Schwierigkeiten — wenn
nötig, muß die Ä therphase zentrifugiert werden. Die
Ä therphase wird verworfen. Bei Schütteln mit Ä ther
und den vorhergehenden Arbeitsgängen ist wegen der
entzündlichen Wirksamkeit des Crotonöls und der Ex­
trakte auf sauberes Arbeiten besonders zu achten. Die
dient Tetramethylsilan (TMS, ö =0,00 ppm). Bei der
tabellarischen Wiedergabe der Spektren werden die
Signale so bezeichnet, wie in Abb. 4 für Phorbol ange­
geben ist; zur Festlegung von Kopplungskonstanten
werden Doppelresonanzmessungen mit herangezogen.
wäßrige Phase wird mit
2
-n. Schwefelsäure auf ph 5
—
Elektronenstoß-Massenspektren sind mit dem Gerät
eingestellt (Verbrauch ca. 7 ml). Nach Zusatz von
CH-4 der Fa. MAT Bremen, Elektronenanlagerungs-
Massenspektren am Forschungsinstitut Manfred v. Ar­
denne, Dresden-Weißer Hirsch, gemessen. Zur Säulen-
chromatographie wird, wenn nicht anders angegeben,
Kieselgel der Fa. E. Merck (Korngröße 0,05 —0,20 mm,
mit 13 Gew.-% Wasser desaktiviert) verwendet.
30 ml gesättigter wäßriger Natriumsulfatlösung läßt
man über Nacht kühl stehen. — Man filtriert dann
vom ausgefallenen Bariumsulfat ab, bringt das Filtrat
mit einigen Tropfen 2-n. Natronlauge auf pn 7 und
schüttelt erst mit 250 ml Essigester, dann 2-mal mit je
200 ml Ä ther aus. Die organischen Phasen werden ver­
worfen und die wäßrige Phase am Rotationsverdamp­
fer bei 45 —50° eingeengt, bis bei ölpumpenvakuum
nichts mehr übergeht. Der ölige, viel Glycerin enthal­
tende Rückstand wird mit 50 ml absolutem Ä thanol in
der Kälte digeriert. Die nach Absaugen verbleibenden
Salze werden 4-mal mit je 50 ml warmem abs. Ä thanol
extrahiert. Der Salzrückstand darf beim Kochen mit
konz. HCl nur eine schwache Rotfärbung ergeben
Untersuchung auf reduzierende
W i r k u n g
Toi lens Reagenz: Zu 1ml einer n/10 wäßrigen
Silbernitratlösung gibt man so viel 2,5-proz. wäßrigen
Ammoniak, bis sich der zuerst gebildete Niederschlag
gerade wieder gelöst hat (ca. 4 Tropfen). Diese Lösung
wird zu wenigen mg Phorbol in 0,5 ml Methanol gege­
ben. Beim Erwärmen tritt nach
schwarzer Niederschlag auf.
1
—2 Min. ein braun­
(
„Phorbolreaktion“16) . Die vereinigten äthanolischen
Extrakte werden auf ca. 50 ml eingeengt und kühl ge­
stellt. Im Verlauf einiger Tage kristallisiert Alkohol-
*
Wegen des Vorkommens von Phorbol in Croton tiglium L. phorbol aus. Die Kristallisationsgeschwindigkeit ist
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1
212
E.HECKER UND ANDERE
stark von der Viskosität des Glycerin-haltigen Rück-
UV (in Äthanol, 0,1 cm Küvette und Dioxan, 1 cm Kü-
standes abhängig — es empfiehlt sich, die Ansätze an- vette) : vgl. Abb. 2.
zuimpfen **. Die Kristalle werden auf einer G2-Fritte
abgesaugt und mehrmals mit wenig eiskaltem abs.
Äthanol gewaschen. Ausbeute an Rohprodukt 5,3 bis
CD (in Dioxan) : vgl. Abb. 3.
IR (in KBr) : J’OH 3500 (scharf) und 3250 (breit) ;
j'C = O 1700; rC = C 1640/cm.
6
,0 g (1,1 —1,2 Gew.-% des eingesetzten Crotonöls).
KMR (in d6-DMSO und d
und Abb. 4.
5
-Pyridin/D 0 ) : vgl. Tabn.
2
Zur Reinigung werden 5 g Rohprodukt in 40 ml Ätha-
nol/Wasser (10/1) unter Erwärmen gelöst. Aus der
heiß filtrierten Lösung kristallisiert beim längeren
Stehen Alkoholphorbol in farblosen Kristallen. Aus-
beute: 1,6 —2,0 g, Schmp. zwischen 238 und 243°.
Weitere 2,0 bis 2,2 g Alkoholphorbol mit einem Schmp.
zwischen 228 und 234° lassen sich durch Einengen der
Mutterlauge auf die Hälfte und erneutes Stehenlassen
gewinnen. Diese Fraktionen müssen nochmals umkri-
stallisiert werden. Charakterisierung einer Fraktion
vom Schmp. 238 —239°:
1
,
2
P h o r b o l - e s t e r
Phorbol-(a,b,c)-triacetat (Pentahydroxy-tigliadienon-
a,b,c)-triacetat): Zu 500 mg (1,4 mMol) Phorbol
(
—
in 15 ml abs. Pyridin gelöst — werden 1,5 ml (14
mMol) Acetanhydrid getropft. Nach 19 Stdn. Stehen
bei Raumtemperatur wird der Ansatz zu 100 ml Was-
ser in einen 250 ml-Scheidetrichter gegeben. Nach
gutem Durchmischen schüttelt man 4-mal mit je 50 ml
Äther aus. Die Wasserphase wird verworfen, sie ent-
hält keine Phorbol-ester mehr. Die Ätherphasen wer-
den vereinigt und zur Entfernung des Pyridins 3-mal
mit 100 ml I-tx. Schwefelsäure ausgeschüttelt. Schließ-
lich wird 1-mal mit 100 ml Wasser, 1-mal mit 100 ml
gesättigter NaHC03-Lösung und 3-mal mit 100 ml Was-
UV (in Äthanol) : Ama.\ 234, 333 m ju (e 4370,
IR (in KBr) : rOH 3370 (breit) ; rC = 0 1720; rC = C
630/cm.
6
6
).
1
Zur Überführung von Alkoholphorbol in „Wasser-
phorbol“ werden 1 0 g Alkoholphorbol in 47 ml Wasser
kalt gelöst. Die Lösung wird im offenen Kolben in ein
Wasserbad von 60 —80° gestellt und gelegentlich um-
ser gewaschen. Die Ätherphase wird über M gS0
trocknet und abrotiert. Ausbeute 607 —663 mg (90 bis
8%) dünnschichtchromatographisch einheitliches Pro-
dukt. Zur weiteren Reinigung werden 500 mg Rohpro-
dukt aus ml Benzol/Petroläther (Sdp. 60 —70°)
l / l umkristallisiert. Man erhält 377 mg farbloser
4
ge-
geschüttelt. Nach 30 —40 min sind
6
—7 g (60 —70
9
Gew.-%) Phorbol in farblosen Kristallen ausgefallen,
deren Schmp. zwischen 227 und 241° liegt. Die Mutter-
lauge kann zum Überführen von weiterem Alkohol-
phorbol in Phorbol verwendet werden.
1
1
=
Kristalle vom Schmp. 120 —122°. Nochmaliges Umkri-
stallisieren aus 4 ml desselben Lösungsmittels liefert
258 mg Phorbol-triacetat vom Schmp. 110 —111°,
Aus wäßriger Lösung kristallisiertes Phorbol ist
schwer löslich in CC1
4
, CHC1 , Acetonitril, Essigester,
3
Nitromethan, Aceton, Äthanol, Wasser, Eisessig und
Dioxan; es ist gut löslich in Dimethylsulfoxyd, Di-
methylformamid, Pyridin und Gemischen von Äthanol,
Aceton oder Dioxan mit Wasser.
[a]
+
6
6
° (1% in Dioxan). — Die am Hochvakuum
zur Gewichtskonstanz getrocknete Substanz enthält noch
1,3% Benzol, wie sich aus der Integration des Benzol-
signals bei 7,36 ppm im KMR-Sepktrum ergibt (Lö-
sungsmittel CDC13) .
Charakterisierung einer Fraktion vom Schmp. 238,5
bis 240,5° ; [a] + 1 1 6
0
( 0 1,4% in D ioxan):
C
2 6
U
3 4
O
9
(490,6)
Ber. C 63,66 H 6,97 O 29,25.
+1,3% C
CigH
2
gOg (350,4)
Ber. C 65,12 H 7,48 O 27,40,
(352,4)
Ber. C 64,75
CooIUoOg (366,5)
Ber. C 65,55 H 8,25 O 26,20,
(364,4)
C
26
H
3 4
O
9
6
H
6
Ber. C 64,03 H 6,98 O 28,97,
Gef. C 63,86 H 6,84 O 29,04.
C
1 9
H
28
O
6
H
8
, 0
1
0
27,24,
Elektronenanlagerungs-Massenspektrum (tv 120 °C):
Massenspitzen mit mehr als 15% rel. Intensität
C20
H
28
O
6
m/e
/[%]
490 472 430 412 370 310 292
30 17 78 100 60 50 100
Ber. C 65,91 H 7,74
Gef. C 65,67 H 7,82
C 65,76 H 7,89
0
0
0
26,34,
26,66,
26,58.
UV (in Äthanol): Amax 194 —200, 232, 334m // (e
2000, 5200, 70),
1
Massenspektren:
spektrum vgl. Abb.
CH-4, 70 eV, Massenspitzen m/e ^ 282 mit mehr als
5% rel. Intensität) :
Elektronenanlagerungs - Massen- UV (in Dioxan): Amax (230), 248, 335m // (e 5500,
1
. Elektronenstoß-Massenspektrum
5000, 70).
(
2
CD (in Dioxan): Min. 266, Min. 345m // (A e —1,03,
-
0 ,6 5 7 ).
m/e
[%]
282
26
300
31
310
43
328
100
346
34
364
0
IR (3,6% in CHCI3) : rOH 3380 (breit) und 3550
/
(scharf); rC = 0 1700, 1725; v C = C 1623/cm.
*
* Unser erster, von H. J.
j
a R c z y k bereiteter Phorbolansatz
tH. kauFFmann freundlicherweise zur Verfügung stellte,
brachten den Ansatz innerhalb weniger Stdn. zur Kristal-
lisation.
stand mehr als 2 Jahre (Okt. 1959 bis Jan. 1962) bei 4°
im Kühlschrank, ohne zu kristallisieren. Zugabe einiger
unreiner Kristalle von Alkoholphorbol, die Herr Prof. Dr.
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ub e r D ie Wir K s T o f f e D e s c r o T o n ö l s V ii
1213
Bei Verdünnung 1:20 in 20-facher Schichtdicke telt bis alles Acetanhydrid hydrolysiert ist und dann
keineVeränderungen imOH-Bereich; vC —C 1592 2 Stdn. sich selbst überlassen. Das ausgefallene Pro­
und 1620/cm.
dukt nimmt man in 200 ml Methylenchlorid auf und
KMR-Spektrum (in CDC13) :vgl. Tab. 3.
schüttelt die wäßrige Phase 3-mal mit je 100 ml Methy­
Bestimmung des Lösungsmittelgehaltes von aus lenchlorid aus. Die vereinigten organischen Phasen wer­
CC1
umkristallisiertem Phorbol-triacetat durch Ele­ den 5-mal mit 100 ml 5-proz. KHC0 -Lösung, dann mit
mentaranalyse: 304 mg Phorbol-triacetat werden aus 200 ml Wasser gewaschen und über MgS0 getrocknet.
ml CCI
umkristallisiert. Man erhält 229 mg farb­ Das erhaltene Rohprodukt (1,08 g) wird an 200 g Kie­
loser Kristalle vom Schmp. 113 —116°. Nochmaliges selgel chromatographiert: das Pentaacetat läßt sich mit
Umkristallisieren aus 3 ml CC1
liefert 179 mg vom CHC12/Ä ther = 20/1 eluieren. Um geringe Mengen
Schmp. 114—116°.
(490,6)
Ber. C 63,66 H 6,97 O 29,35,
Gef. C 47,50 H 5,38 0 22,69 CI 24,70.
4
3
4
4
4
4
2
stark gefärbter Substanzen abzutrennen, wird das nach
Chromatographie erhaltene Harz in wenig Ä ther ge­
löst; es kristallisieren 934 mg (80% d. Th.) farbloser
Kristalle vom Schmp. 169 —172°. Nach Umkristalli­
sieren aus Petroläther/Äther liegt der Schmp. bei 170
bis 173°, [a] +108° (1% inDioxan).
C
2 6
O
3 4
O
9
Die Substanz enthält demnach 26,8 Gew.-% CC14,
entspr. 1,2 Mole CC1 pro Mol Triacetat.
4
C3oH3
80n (574,60)
Ber. C 62,71 H 6,62,
Gef. C 62,44 H 6,59.
2
29 mg (0,87 mMol) Phorbol-triacetat werden mit
.4-Dinitrophenylhydrazon von Phorbol-triacetat:
4
6
36 mg (4,78 mMol) 2.4-Dinitrophenylhydrazin in
2
7
5 ml Chloroform/Eisessig = l/l gelöst. Man erhitzt UV (in Methanol) : Amax 245, 316 m/i (e 4650, 76).
0 Stdn. am Rückfluß auf 70°, setzt nach dieser Zeit IR (in CH2 C12) : rC=0 1712, 1730; rC=C 1635/cm.
weitere 427 mg (2,44 mMol) Dinitrophenylhydrazin zu KMR (in CDC13) : Gegenüber Triacetat ist verändert:
und kocht —nachdem verdunstetes Lösungsmittel er­
setzt wurde — weitere 70 Stdn. am Rückflußkühler.
Nach dem Abkühlen setzt man 25 ml Wasser zu und
7,15 ppm (1 A) ; 2,68 und 2,45 ppm (2 B); 1,93
bis 2,11 ppm (5 Acetylgr.) ; 1,13 und 1,28 ppm
(3 B, C).
schüttelt mit insgesamt 250 ml CH
2
C1
2
aus. Die ver­
Phorbol-(a,b,c) -tribenzoat
(Pentahydroxy-tigliadie-
einigten organischen Phasen werden mit 5% wäßriger non-(a,b,c)-tribenzoat: 5 g Wasserphorbol (13,7 mMol)
KHCOg-Lösungund Wasser gewaschen und über MgS0
getrocknet. Die Säulenchromatographie des Trocken­ (87,5 mMol) Benzoylchlorid versetzt. Nach kurzemU ­
rückstands (Systeme nacheinander Petroläther/Äther schütteln läßt man 18 Stdn. bei Raumtemperatur stehen.
4
werden in 50 ml abs. Pyridin gelöst und mit 15 ml
=
9/1, 4,5/1 und 2/1) liefert 136 mg (23% d. Th.)
Danach wird der Ansatz in 400 ml Wasser gegossen
und über Nacht gerührt, um entstandenes Benzoesäure­
anhydrid zu zerstören. Man setzt 300 ml Methylen­
chlorid zu und arbeitet auf, wie für Phorbolpentaacetat
beschrieben, wobei zunächst mit 1-n. HCl, dann mit
dünnschichtchromatographisch einheitliche Substanz,
i?/-Wert 0,46 in Methylenchlorid/Aceton = 11:1. Nach
Umkristallisieren aus Petroläther/Äther = 2/1 erhält
man 91 mg orangefarbener Nadeln vom Schmp. 250
bis 251°, [a] - 213° (1%inDioxan).
5
-proz. KHC03-Lösung und schließlich mit Wasser ge­
waschen wird. Der Trockenrückstand wird an 900 g
A1 (neutral, Akt. IV) chromatographiert (Elutions­
mittel nacheinander CC14, CC1 /CHC1 = 9/1, 8/2
C
3 2
H3 8
0
1 2
N
4
(470,7)
Ber. C 57,31 H 5,71 N 8,35,
Gef. C 57,23 H 5,84 N 8,35.
UV (in Methanol) : 2max 257, (290), 384 ny* («15200,
6600), 28300).
IR (in KBr) : 3390, 1740, 1720, 1605, 1585, 1510,
500/cm.
KMR-Spektrum (in CDC13) : Gegenüber Triacetat sind
2
0
3
4
2
2
und 7/3). Nach Abziehen des Lösungsmittels wird der
Rückstand aus wenig Aceton umgelöst, um geringe
Verunreinigungen abzutrennen. Man erhält 6,5 g (70%
d. Th.) farblose Nädelchen vom Schmp. 152 —156 und
(
1
213 —215°. Nach 24 Stdn. Trocknen im Hochvakuum
folgende Signale verändert oder neu hinzugeko ­
men: ppm (> NH austauschbar); 9,1 ppm
/ =2 Hz, H-3') ; 8,3 ppm (/ =10 und2 Hz, H-5') ;
bei 110° wird nur der Schmp. 215 —217° gefunden,
[a] —15° (1% inDioxan).
1
1 , 8
(
C4 1
H4 0
O9
(676,7)
Ber. C 72,76 H 5,96,
Gef. C 72,84 H 6,09.
7
,9 ppm ( / = 1 0 Hz, H-
6
'); 6,67 ppm (1 A); 2,6
und 2 , 8 ppm (2 B) ; 1,9 ppm (3A). Die Protonen
am aromatischen Kern sind bei normaler Zählung
gestrichen bezeichnet.
UV (in Methanol):Amax230 th/j, (£ 53000).
IR (in KBr): rOH 3400; vC=0 1695, 1715; rC=C
580,1595, 1620/cm.
KMR (in CDC13) : Gegenüber Triacetat ist verändert:
,3 —8,1 ppm (ca. 16 Protonen); 5,87 ppm (1 C);
,33 und 1,47 ppm (3 B, C). Die Signale B, D,
E, 2 Aund 2 B sind um 0,1 —0,2 ppm nach klei­
00 ml Wasser gegossen. Das Gemisch wird geschüt­
nemFeld verschoben.
Phorbol-(a,b,c,d,e) -pentaacetat (Pentahydroxy-tiglia-
dienon-(a,b,c,d,e)-pentaacetat: 1,04 g (2,1 mMol)
Phorbol-triacetat werden in 50 ml Acetanhydrid gelöst,
mit 1,1 g p-Toluolsulfonsäure versetzt und bei Raum­
temperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch ver­
färbt sich über grün nach braun. Nach 48 Stdn. wird
der Ansatz in eine Lösung von 1,5 g Natriumacetat in
1
7
1
1
1
1
3
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1
214
ÜBER DIE WIRKSTOFFE DES CROTONÖLS VII
Reduktions- und Hydrierungsprodukte KMR (in CDClg) : Gegenüber Phorbol-triacetat ist ver­
ändert: ca. 5,8 ppm
(
1
A) ; ca. 5,5 ppm (bei Re­
Phorbol-(f)-ol (H exahydroxy-tigliadien): Die Re­
duktion entstandenes Proton); um2,1 ppm (4 Ace-
tylgruppen).
duktion von Phorbol-triacetat mit LiAlH
chend der zur Reduktion der Wirkstoffe angegebenen
Vorschrift ausgeführt. Aus 600 mg (1,2 mMol)
4
wird entspre­
-
<
7
(a) -Desoxy-tetrahydro-phorbol- (b,c) -diacetat (a-Des-
Phorbol-triacetat werden mit 456 mg (12 mMol) oxy-tetrahydroxy-tiglianon-(b,c)-diacetat): 800 mg (
1 , 6
LiAlH
stallisation aus 5 ml Methanol liefert 288 mg Substanz bei Normaldruck und Raumtemperatur mit 1,2 g Pal­
% Pd) als Katalysator hydriert.
4
332 mg amorphes Produkt erhalten. Die Kri­ mMol) Phorbol-triacetat werden in 100 ml Essigester
vom Schmp. 210 —214°. Nach erneutem Umkristalli­ ladium/Tierkohle (
1 0
sieren aus demselben Lösungsmittel erhält man 254 mg Nach 60 Stdn. ist die Reaktion beendet. Durch präpa­
vom Schmp. 218 —220°, die nochmals umkstrillasiert rative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Chlo­
werden: 210mg vomSchmp. 222 —225° (47% d. Th.), roform/Essigester = 10/3, ungesättigte Kammer) kann
[
a] +54° (2% in Methanol). Rf im System Ace­ ein in geringer Menge entstehendes Nebenprodukt vom
ton/Essigester = 3/2 (ungesättigte Kammer, Besprühen Rf ca. 0,4 abgetrennt werden. Das gesuchte Hydrie­
mit wäßriger KMn0
20^30^6 (366,5)
Ber. C 65,55 H 8,25 O 26,20,
Gef. C 65,10 H 8,56 O 26,57.
UV (in Ä thanol) : keine Absorption oberhalb 210 m/u.
4
-Lösung) :0,4.
rungsprodukt zeigt einen Rf von ca. 0,7 —die entspre­
chende Zone kann auf der Platte durch Besprühen
eines schmalen Spaltes mit Vanillin-Schwefelsäure-Rea-
genz3 1 ermittelt werden: man erhält eine grüne Fä r­
bung. Ausbeute ca. 600 mg (85% d. Th.) eines farb­
losen Harzes, [a] +131° (1% inDioxan).
^
IR (in KBr) : rOH 3330 —3390 (breit) ; breite Bande Elektronenstoß-Massenspektrometrie: hödiste Massen­
zwischen 1625 und 1650/cm.
spitze bei m/e 376.
Phorbol-(f),ol-(a,b ,c,f) -tetraacetat (Hexahydroxy-ti- UV (in Methanol) : /max 194, 308
gliadien-(a,b,c,f)-tetraacetat: 117 mg (0,32 mMol)
(e 2200, 40).
IR (inKBr) : rOH 3415; rC=0 1725,1740/cm; keine
C=C-Banden zwischen 1610 und 1660/cm.
KMR (in CDC13) : 5,4 ppm (/ = 10 Hz, 1C); um
Phorbolol werden in 4 ml abs. Pyridin gelöst und nach
Kühlen imEisbad mit 2 ml (13,3 mMol) Acetanhydrid
versetzt. Danach läßt man 24 Stdn. im Kühlschrank
stehen. Die Aufarbeitung erfolgt nach den früher ge­
gebenen Vorschrift 2/7. Nach dem ersten Umkristallisie­
ren werden 130 mg Substanz, Schm. 186 —187° erhal­
ten. Ein zweites Umkristallisieren liefert 121 mg Sub­
stanz, Schmp. 189°, ein drittes 111mg vom Schmp.
89° (65% d. Th.), Rf 0,25 (Benzol/Essigester = 3/1,
Kammer ungesättigt, Anfärben mit wäßriger KMn04-
Lösung).
28^38^10 (534,6)
Ber. C 62,91 H 7,16 O 29,93,
Gef. C 63,03 H 7,00 O 29,96.
2
,
1
ppm ca.
1
0
Protonen, davon Acetylgruppen;
2
um 1,0 —1,3 ppm ca. 15 Protonen; 0,7 ppm (/ =
,5 Hz, G) ; OH (austauschbar) bei 2,5 und
,0 ppm.
5
5
1
1
Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t
haben wir für eine Sachbeihilfe zu danken. U ltram ikro-
analysen nach W a 1i s c h verdanken wir H errn Dr.
H. Reimlinger, Brüssel, circulardichroitische M essun-
gen H errn Doz. Dr. G. Snatzke, Bonn. KM R-Spektren
wurden freundlicherweise von H errn Dr. J. s o n n e n -
bichler, München und H errn Dr. A. M elera, Zürich,
aufgenommen. Elektronenstoß-M assenspektren verdan-
ken wir H errn Prof. Dr. G. S p iteller, vormals W ien,
und Herrn Prof. Dr. F. Weygand, München. F ür Elek-
^
Elektronenstoß-Massenspektrum: Molekularspitze bei
m/e 534.
UV (in Methanol) : Am ax 194,5 m/i (e 16000).
IR (inKBr) : rOH 3400 (scharf) ; rC=0 1730; breite, tronenanlagerungs-M assenspektren danken wir H errn
intensive Bande zwischen 1230 und 1240/cm.
Prof. Dr. M. v. Ardenne, Dresden.
31 J. S. m
a t H e W s , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 69, 163 [1963].
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