K. BAUER
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Mycel-Extrakt: Nach Abfiltrieren und gründlichem
Nach Zugabe von 6 g Dicyclohexylamin fiel das Di-
cyclohexylammoniumsalz aus. Es wurde unter Zusatz
von Aktivkohle aus Wasser umkristallisiert.
Waschen mit 0.1 M Phosphatpuffer (KH2P04/K0H)
pH 7,0, der pro Liter 20 mMol Mercaptoäthanol und
5 mMol Magnesiumacetat enthielt, wurden 20 g Mycel
mit 40 g Glasperlen ( 0 0,11mm) in einer Reibschale
zu einer homogenen Masse zerrieben. Dann zentrifu-
gierte man 1 Stde. bei 4 °C und 30 00 g. Der Über-
stand wurde sofort für die Inkubationsversuche verwen-
det. Proteingehalt: 15 mg/ml.
Ausbeute: 8,9 g (49,5% d. Th.); Schmp.: 134 °C.
Analyse: Ber. C 65,36 H 8,06 N 4,74,
Gef. C 65,02 H 7,88 N 4,72.
N-Tosyl-L-a-Aminoadipinsüure
Inkubationsversuche: In Gärröhrchen wurden die
unten aufgeführten Komponenten vermischt und 45
Min. bei 28 °C inkubiert.
10 g des Salzes wurden zur Freisetzung der Säure
in 500 ml ätherischer HCl suspendiert. Nach 15 min
Rühren wurde vom Dicyclohexylammoniumchlorid ab-
filtriert, die Lösung i. Vak. eingedampft und der Rück-
stand, der beim Stehenlassen kristallisierte, aus Tetra-
chlorkohlenstoff umkristallisiert.
1. Inkubations-Ansatz: 1 ml Extrakt, 0,01ml 0,5 m
ATP (5//Mol), 0,01ml 0,5
m
Phosphoenolpyruvat (5
//Mol), 20 /ug Pyruvatkinase gelöst in 0,01 ml Wasser,
0,01 ml 1M Magnesiumacetat (10 //Mol), 0,1 ml 0,01 M
L-Cvstein (1 //Mol), 0,1 ml 0.01 M DL-a-Aminoadi-
pinsäure (l//Mol), 1//Ci [//-14C]-L-Valin * (6,9 mCi/
mMol) gelöst in 0,01 ml Wasser, 1ml 0,5 M Phosphat-
puffer (KH2P04/K0H) pH 7.
Ausbeute: 5,5 g (81% d. Th.); Schmp.: 98 °C.
[a]d +25,6 (C= l in CC14).
Analyse: Ber. C 59,16 H 5,71 N 3,45,
Gef. C 59,45 H 5,62 N 3,39.
2. Inkubations-Ansatz: 0,1 ml 0,01 M L-Valin (1
//Mol), 1//Ci [3-14C]-DL-Cystein (17 mCi/mMol). Alle
übrigen Komponenten wie beim 1. Inkubations-Ansatz
beschrieben.
S-Benzyl-N-BOC-t-System und N-BOC-l-14C-Valin
Diese wurden nach der pH-stat-Methode von s c h n a -
B e l 15 synthetisiert. Die Verbindungen erwiesen sich bei
dünnschichtchromatographischer Untersuchung an Kie-
selgel G mit Essigester/Pyridin/Essigsäure/Wasser (5 :
5:1: 3) und Dioxan/Methanol/Triäthylamin (10 :
10 : 1) als einheitlich.
Identifizierung der Peptide: Durch Zugabe von 10ml
Äthanol wurde die Inkubation abgestoppt und das ge-
fällte Protein abzentrifugiert. Die Lösung wurde i. Vak.
eingedampft und der Rückstand der Perameisensäure-
oxydation8 unterworfen. Dann dampfte man i. Vak.
ein, löste den Rüstand in 5 ml Wasser, gab die Lösung
über eine Säule (1,5 x 10 cm) von Dowex 50WX12
(H®-Form) und dampfte den Durchlauf i. Vak. ein.
Aus dem Rückstand wurden durch Hochspannungs-
elektrophorese und Papierchromatographie die radio-
chemischen reinen Sulfonsäure-Derivate der Peptide
erhalten und ihre Identität mit den synthetisch gewon-
nenen Vergleichssubstanzen nachgewiesen.
Radioaktivitätsmessungen mit dem radiochemisch
reinen Sulfonsäure-Derivat 5-(2-Aminoadipyl) -cystei-
nyl-valin ergaben, daß sich 0,5 nMol des Tripeptids ge-
bildet hatten. Dies entspricht einer Umsatzrate von
0,37% (bezogen auf eingesetztes Valin). Die Radioakti-
vitätsmessungen wurden mit dem Flüssigkeits-Szintil-
lationszähler Packard TriCarb 526 durchgeführt. Die
Auswertung der Papier- und Elektropherogramme er-
folgte außerdem durch Autoradiographie.
Zur Synthese des N-BOC-L-14C-Valins wurden 117
mg L-14C-Valin (50 //Ci/mMol) eingesetzt. Die Um-
setzung dauerte 12 Stdn. bei einem pH von 9,5. Erhal-
ten wurden 200 mg (92,5%) N-BOC-L-14C-Valin.
Aufbau des Peptids an der festen Phase
8
g chloromethyliertes Polystyrol (Bio-Rad, Bio-
Beads S.X-2, 200—400 mesh, 1,04 meq Cl/g) wurden
90 Stdn. mit 200 mg V-BOC-L-14C-Val (0,92 mMol)
und 101mg (1 mMol) Triäthylamin in 50 ml abs. Te-
trahydrofuran unter Rückfluß gekocht. Nach dem Abfil-
trieren wurde mit Tetrahydrofuran, Methanol, Wasser
sowie Methanol gewaschen. Zur Bestimmung des l-14C-
Valin-Gehaltes wurde die BOC-Schutzgruppe mit 1N
HCl/Eisessig abgespalten, das Hydrochlorid mit Tri-
äthylamin zersetzt und der Chlorid-Gehalt des Filtrats
nach Vol h ar d bestimmt: 0,65 mMol L-14C-Val/8 g
Harz (Ausbeute: 70%).
In einem 100-ml-Reaktionsgefäß mit Absaugfritte
wurde folgender Synthesezyklus durchgeführt: (jeweils
50 ml Flüssigkeit)
N-Tosyl-L-a-Aminoadipinsäure-a-benzylester
(Dicyclohexylammoniumsalz)
9,45 g (0,03 Mol) TV-Tosyl-L-a-Aminoadipinsäure12
wurden in 25 ml Dimethylformamid, das 3,03 g (0,03
Mol) Triäthylamin enthielt, gelöst. Nach Zugabe von
5,25 g (0,033 Mol) Benzylbromid wurde die Mischung
bei Raumtemp. über Nacht stehen gelassen. Danach
wurde 100 ml Wasser zugegeben und die Reaktions-
mischung 3-mal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert.
Die organische Phase wurde 2-mal mit 30 ml Wasser
gewaschen, mit MgS04 getrocknet und i. Vak. einge-
dampft. Das zurückbleibende Öl wurde in 25 ml Tetra-
hydrofuran gelöst und mit 25 ml Petroläther versetzt.
1. Entfernen der Schutzgruppe mit 1N HCl/Eisessig
(30 Min.), Eisessig (3-mal je 3 Min.), Äthanol (3-
mal je 3 Min.), Methylenchlorid (3-mal je 3 Min.).
2. Freisetzen der Aminogruppe mit Triäthylamin (3
ml)/Methylenchlorid (10 Min.), Methylenchlorid
(6-mal je 3 Min.).
3. Kupplung durch Zugabe der geschützten Aminosäu-
ren (65 mMol) in Methylenchlorid; nach 10 Min.
15 E. S c h n a b e l, Liebigs Ann. Chem. 702, 188 [1967],
Unauthenticated
Download Date | 11/18/19 5:53 AM
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