Functional Disruption of the Cancer-Relevant Interaction between Survivin and Histone H3 with a Guanidiniocarbonyl Pyrrole Ligand

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The protein Survivin is highly upregulated in most cancers and considered to be a key player in carcinogenesis. We explored a supramolecular approach to address Survivin as a drug target by inhibiting the protein–protein interaction of Survivin and its fu

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Title: Functional disruption of the cancer-relevant interaction between
Survivin and Histone H3 with a guanidiniocarbonyl pyrrole ligand
Authors: Cecilia Vallet, Dennis Aschmann, Christine Beuck, Matthias
Killa, Annika Meiners, Marcel Mertel, Martin Ehlers, Peter
Bayer, Carsten Schmuck, Michael Giese, and Shirley Karin
Knauer
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Functional disruption of the cancer-relevant interaction between
Survivin and Histone H3 with a guanidiniocarbonyl pyrrole ligand
Cecilia Vallet*[a], Dennis Aschmann[b], Christine Beuck[c], Matthias Killa[b], Annika Meiners[a], Marcel
†
[b]
Mertel[b], Martin Ehlers[b], Peter Bayer[c], Carsten Schmuck , Michael Giese*[b] and Shirley K. Knauer*[a]
†
In Memory of Prof. Dr. Carsten Schmuck (20.02.1968 – 01.08.2019)
Abstract: The protein Survivin is highly upregulated in most cancers
and considered to be a key player of carcinogenesis. We explored a
supramolecular approach to address Survivin as a drug target by
inhibiting the protein-protein interaction of Survivin and its functionally
relevant binding partner Histone H3. Ligand L1 is based on the
guanidiniocarbonyl pyrrole cation and serves as a highly specific
anion binder in order to target the interaction between Survivin and
Histone H3. NMR titration confirmed binding of L1 to Survivin’s
Histone H3 binding site. The inhibition of the Survivin-Histone H3
interaction and consequently a reduction of cancer cell proliferation
were demonstrated by microscopic and cellular assays.
Survivin is overexpressed in almost all malignant tumors and is
considered an early diagnostic and prognostic biomarker.[1] The
protein has been associated with a resistance against chemo- and
radiotherapy and a poor clinical outcome.[2] Survivin is involved in
two key processes of carcinogenesis: As a member of the inhibitor
Fig. 1: The interaction between Survivin (blue) and Histone H3 (green) is
essential for Survivin to fulfil its role in mitosis as a member of the Chromosomal
of apoptosis protein (IAP) family, it counteracts cell death, and as
part of the chromosomal passenger complex (CPC) it promotes
cell proliferation.[3] As Survivin is mainly expressed during
embryonic development but mostly absent in terminally
differentiated adult tissues, it is considered to be one of the most
cancer-specific proteins identified so far.[4] However, Survivin
possesses no enzymatic activity, which makes it challenging to
address the protein as a drug target. Current therapeutic
strategies include antisense oligonucleotides, siRNAs, small
molecule inhibitors, gene therapy and immunotherapy but none of
these approaches has yet reached the clinic.[5] We aimed to
identify a ligand that specifically interferes with the protein-
protein-interaction (PPI) between Survivin and its functionally
relevant binding partner Histone H3. Twenty years ago, PPIs
were still thought to be “intractable” as PPI interfaces are, in
contrast to the deep cavities that typically bind small molecules,
flat and large.[6] Recently, the modulation of PPIs has shown more
and more promising results since supramolecular chemistry has
emerged as a novel tool to target protein interfaces.[7,8] However,
the design of ligands, which specifically address a well-defined
hot spot on the protein surface, remains challenging.[9]
Passenger Complex (CPC), which consists of Survivin, Borealin (light blue),
AuroraB (grey), INCENP (yellow). The supramolecular guanidiniocarbonyl
pyrrole cation (GCP) ligand L1 (turquoise) was designed to inhibit the interaction
between Survivin and Histone H3 and thereby decrease cancer cell proliferation.
The most successful approaches so far have used compounds
that display specific, well-characterized recognition properties for
amino acids and peptides in order to functionally modulate PPIs.[7]
Some well-known examples are Calixerenes that were linked to
peptide loops to mimic the structure of antibodies and inhibit the
interaction between cytochrome c and the cytochrome c
peroxidase, Cucurbiturils that have been used to induce and
reversibly control the dimerization of proteins or lysine- and
arginine-specific molecular tweezers that are able to disrupt the
PPI between 14-3-3 and its partner proteins C-Raf and ExoS.[10]
We show a proof-of-concept using supramolecular chemistry to
design a ligand based on the guanidiniocarbonyl pyrrole cation
(GCP) in order to target the interaction between Survivin and
Histone H3. The guanidinium moiety in the form of arginine is not
only present in the active sites of many enzymes as binder for
anionic substrates but has in addition proven to be an excellent
binding motif in supramolecular chemistry. Guanidinium scaffolds
have been used to develop artificial receptors that are able to bind
oxoanions through hydrogen bonding as well as hydrophobic and
charge pairing interactions.[11] The cationic guanidiniocarbonyl
pyrrole (GCP) is a rigid planar analogue with superior binding
properties in aqueous solvents containing competing anions and
salts, which makes it suitable for applications in a cellular
environment. It has already successfully been used by us for the
design of artificial receptors for amino acids, oligopeptides or
oligonucleotides and in artificial transfection vectors for gene
delivery.[12]
[a]
[b]
[c]
Dr. C. Vallet, A. Meiners, Prof. Dr. S.K. Knauer
Department of Molecular Biology II, University of Duisburg-Essen
Universitätsstraße 5, 45141 Essen, Germany
E-mail: cecilia.vallet@uni-due.de; shirley.knauer@uni-due.de
D. Aschmann, M. Killa, M. Mertel, Dr. M. Ehlers, Prof. Dr. C.
Schmuck, Prof. Dr. M. Giese
Institute for Organic Chemistry, University of Duisburg-Essen
E-mail: michael.giese@uni-due.de
Dr. C. Beuck, Prof. Dr. P. Bayer
Department of Structural and Medicinal Biochemistry, University of
Duisburg-Essen
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O
These results clearly show that L1 interacts with Survivin’s
Histone H3 binding site. Whether L1 is taken up by cells and able
to inhibit the interaction between the two proteins in a cellular
environment was verified with two different approaches. First, we
performed a co-immunoprecipitation. For this assay, HeLa cells,
which are derived from cervical cancer, were transfected with
HA-tagged Survivin and treated with different ligand
concentrations or the respective amount of DMSO as a control.
After 24 h of incubation, cell lysates were generated and
incubated with magnetic HA-antibody-coupled beads, which
allowed the elution of Survivin-HA together with all other proteins
bound to Survivin including Histone H3. The amount of
Histone H3 bound to Survivin was then quantified via Western
Blot analysis. We were able to show that L1 indeed reduced the
interaction between Survivin and Histone H3 in a concentration-
dependent manner. A ligand concentration of 10 µM already led
to a 50 % decrease in Survivin-Histone H3 interaction, while a
concentration of 50 µM caused a decrease of 65 % (Fig. 4A
and B).
H
A
H2N
N
N
HN
O
H
O
NH2
NH2
O
H
NH
N
N
NH2
H
O
O
B
Fig. 2: (A) Chemical structure of the supramolecular GCP ligand 1 (L1) with two
guanidiniocarbonyl pyrrole (GCP) groups (blue). (B) Docking of L1 (turquoise)
to Survivin’s Histone H3 binding site. The dotted lines (orange) indicate
interactions between ligand and protein interaction sites of the ligand are
highlighted in red.
A
B
To identify ligands suitable to target the surface-exposed
anionic Histone H3 binding site of Survivin we performed docking
studies with a focused library of ligands containing one or two
GCP units to address the negatively charged amino acids on the
protein surface. We tested different linkers to vary the distance
between the GCP units in order to achieve the best binding
orientation between ligands and target amino acids and identified
ligand 1 (L1) as the ligand with the best docking score (Fig. 2A
and B).
Fig. 4: L1 is able to inhibit the interaction between Survivin and Histone H3 in
HeLa cells. (A) Immunoprecipitation experiments reveal concentration-
a
dependent inhibition of the Survivin-Histone H3 interaction by L1. (B)
Quantitative analysis of the Western Blot shows the intensity of the Histone H3
signal in the eluate normalized to the respective Survivin-HA signal of HeLa
cells treated with either 10 µM L1, 50 µM L1 or DMSO (control). Experiments
were performed in triplicates. The error bars show the standard error of the
mean. Data was analyzed by t test. Two asterisks (**) indicate a p value smaller
than 0.01.
To map the binding of L1 to distinct residues on the protein
surface, we performed NMR titration experiments (Sup. Fig. 1A).
The titration resulted in chemical shift perturbations at glutamic
acids (E) 65 and 68, aspartic acids (D) 70, 71 and 72 and glutamic
acids (E) 75 and 76 (Fig. 3A). Those amino acids correspond to
the known Histone H3 binding site of Survivin, which comprises
amino acids 51 to 80 [13]. Furthermore, a decrease in NMR signal
intensities indicates a binding equilibrium with kinetics in the
Since Western Blot analysis is considered to be only semi-
quantitative and co-immunoprecipitation was performed with
overexpressed and HA-tagged Survivin, which does not fully
correspond to the natural conditions inside the cell, we verified the
results with an in situ Proximity Ligation Assay (PLA). The PLA
allows the visualization of protein-protein interactions within cells
on an endogenous level. At first, two primary antibodies bind to
the target proteins Survivin and Histone H3.
intermediate time regime (ms), which corresponds to
a
dissociation constant in the µM range. Indeed, also the relative
intensities I/I0 showed a significant decrease within Survivin’s
Histone H3 binding site, thereby indicating ligand binding within
this region. The intensities strongly decreased for glutamic acid
(E) 68, aspartic acid (D) 70, 71 and 72 and glutamic acid (E) 75
(Fig. 3B).
A
B
Fig. 3: NMR titration experiments confirmed binding of L1 to Survivin’s
Histone H3 binding site. (A) Chemical Shift Perturbation (CSP, ∆δ) of 15N-
labeled Survivin 1-120 (300 µM) with L1 (300 µM), compared to protein without
L1, plotted against the Survivin sequence. L1-binding residues with prominent
shift perturbations are colored in red, featuring aspartic and glutamic acid
residues within the Histone H3 binding site of Survivin. (B) The relative signal
intensities show a significant decrease within Survivin’s Histone H3 binding
site indicating ligand binding within this region (red arrow). The histograms in
(A) and (B) only show the region around the H3 binding site, for the full plots
see Figure S1.
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The PLA indeed revealed a significant decrease of the Survivin-
Histone H3 interaction inside the cell upon L1 treatment and
thereby confirmed the results of the co-immunoprecipitation
(Fig. 5A and B).
A
B
As L1 could be shown to inhibit the interaction between Survivin
and Histone H3 inside the cell, we wanted to investigate whether
the inhibitor would consequently also interfere with Survivin’s role
in cell proliferation. Therefore, HeLa cells were treated with 50 µM
of L1 and synchronized before they were fixed during mitosis. The
cells were then immunostained to allow the microscopic
identification of mitotic defects. Cells that displayed mitotic
defects were assigned to one of the five following categories:
Multipolar Pro-/Metaphase, Multipolar Ana-/Telophase, Lagging
Chromosomes, Acentric Fragments and Chromatin Bridges (Fig.
S23).[14] The experiments revealed that ligand treatment
drastically increased the number of mitotic defects in HeLa cells.
While only 6 % of control cells had mitotic defects, the amount
increased to 32 % in ligand-treated cells (Fig. 6A). Furthermore,
L1-treated cells showed a larger variety of mitotic defects in
comparison to the control. In addition to acentric fragments and
lagging chromosomes, also chromatin bridges and multipolar
spindles could be observed (Fig. 6B). This confirms that L1 is
able to interfere with Survivin’s mitotic functions. We quantified
the inhibiting effect of the ligand on cell proliferation by performing
cell proliferation assays in different types of cancer cells: HeLa
cells that are derived from cervical cancer, A549 cells as a model
for lung cancer, MDA-MB-231 cells originating from breast cancer
and HCT 116 cells that serve as a model for colon cancer.
Fig. 5: The inhibiting effect of L1 could be confirmed via PLA. (A) PLA performed
in Hela cells treated with 50 µM L1 or the respective amount of DMSO (control).
Entire cells are depicted in magenta, DNA in blue and PLA foci in yellow. Scale
bar: 20 µm. (B) Quantification of the PLA. The error bars show the standard
error of the mean. N>55. Data was analyzed by t test. One asterisk (*) indicates
a p value smaller than 0.05
Secondary antibodies that are conjugated to a matched pair of
short single-stranded oligonucleotides then recognize these
antibodies. If the two targets are in close proximity (<40 nm), the
oligonucleotides hybridize and ligate with two additional
connector oligonucleotides to form a continuous circular DNA
structure. DNA polymerase then amplifies these circular
structures through rolling-circle amplification with fluorescent
nucleotides that can be detected as PLA signals with fluorescence
microscopy.
A
B
Fig. 6: L1 induces mitotic defects
in HeLa cells and inhibits cell
proliferation. (A) Percentage of
HeLa cells with mitotic defects in
cells treated with 50 µM L1 for 48 h
in comparison to the DMSO
control. (C) Pie charts show
proportions of the different mitotic
defects found in L1-treated cells in
comparison to DMSO-treated cells
(control). N>100. (C) HeLa, A549,
MDA-MB-231 and HCT 116 cells
were treated with different ligand
concentrations or the respective
amounts of DMSO and incubated
for 72 h before cell proliferation
was measured via an MTS assay.
The measured absorbance at
490 nm in L1-treated cells was
normalized to the absorbance in
C
DMSO-treated
cells
of
the
respective cell type (control).
Experiments were performed in
triplicates. The error bars show the
standard error of the mean. Data
was analyzed by a 1way ANOVA
test followed by a Tukey’s Multiple
Comparison test. Two asterisks
(**) indicate a p value smaller than
0.01. Three asterisks (***) indicate
a p value smaller than 0.001.
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The tetrazolium compound [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-
carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophe-nyl)-2H-tetrazolium (MTS)
used for this assay is added to the cells and bioreduced into a
colored formazan product. The quantity of formazan product
measured at 490nm absorbance is directly proportional to the
number of living cells in culture. The assay revealed that L1 was
able to successfully inhibit cell proliferation in all cancer cell lines
tested (Fig. 6C). In three of the four cell lines, proliferation could
an increasing number of mitotic defects and consequently in a
reduction of cancer cell proliferation that was confirmed to be
caused by a specific inhibition of Survivin inside the cells. Further
studies now focus on the development of additional ligands in
order to target other functionally relevant protein-protein
interactions of Survivin. In addition, multivalency is explored as an
approach to further improve and optimize L1 regarding specificity
and affinity.
be decreased by more than 30 %, which is comparable to the
[15]
decrease in proliferation observed in Survivin-depleted cells
.
The inhibition of cell proliferation occurred in a concentration-
dependent manner and the largest effects could be observed in
the breast cancer cell line MDA-MB-231 and the colon cancer cell
line HCT 116.
Experimental Section
All experimental details can be found in Supporting Information.
To confirm that the observed effects of L1 on cancer cell
Acknowledgements
proliferation are Survivin-specific, we performed
a rescue
experiment in which we transiently transfected HCT 116 cells with
Survivin-HA (Rescue) or with GFP (Control). After treating the
cells with L1 for 72 h we measured cell proliferation via an MTS
assay. We were able to observe that an overexpression of
Survivin-HA nearly completely rescued the antiproliferative effect
of L1 in all tested concentrations. While cell proliferation was
reduced to 72 % (50 µM), 67 % (100 µM) and 55 % (200 µM) in
control cells, cell viability could be restored to 97 % (50 µM), 89 %
(100 µM) and 91 % (200 µM) in cells overexpressing Survivin-HA
(Fig. 7). These results suggest that the effects of L1 are indeed
caused by a specific inhibition of Survivin inside the cells.
This work was supported by the collaborative research
center 1093 (CRC 1093) funded by the German Research
Foundation (DFG). Microscopic analyses were performed in
collaboration with the Imaging Centre Campus Essen (ICCE).
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Keywords: Supramolecular chemistry • Molecular recognition •
Survivin • PPI inhibitor • Cancer • Guanidiniocarbonyl pyrrole •
NMR • Confocal microscopy • Apoptosis • Drug discovery •
Inhibitors
References
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Fig. 7: Overexpression of Survivin-HA rescues the antiproliferative effect of L1
in HCT 116 cells and thereby confirms that the observed effects of the ligand
are Survivin-specific. HCT 116 were transiently transfected with Survivin-HA
(Rescue) or GFP (Control) and treated with different concentrations of L1 for
72 h. Cell proliferation was measured via an MTS assay. Experiments were
performed in triplicates. The error bars show the standard error of the mean.
Data was analyzed by a 1way ANOVA test followed by a Tukey’s Multiple
Comparison test. One asterisk (*) indicates a p value smaller than 0.05. Two
asterisks (**) indicate a p value smaller than 0.01. Three asterisks (***) indicate
a p value smaller than 0.001.
Based on a focused library we were able to identify L1 as
potent ligand to target the cancer-relevant protein Survivin by
disrupting the protein-protein interaction with Histone H3. We
verified binding of the ligand to Survivin’s Histone H3 binding site,
which mediates the interaction with Histone H3 in the early stages
of mitosis and is crucial for cell proliferation. In addition, it was
shown that the interaction between the two proteins was
successfully decreased in a cellular environment. This resulted in
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The supramolecular
Cecilia Vallet, Dennis Aschmann,
guanidiniocarbonyl pyrrole ligand L1
targets the Histone H3 binding site of
the protein Survivin, which is highly
upregulated in cancer. Inhibiting the
interaction between the two proteins
successfully reduced cancer cell
proliferation.
Matthias Killa, Annika Meiners,
Christine Beuck, Marcel Mertel, Martin
Ehlers, Peter Bayer, Carsten Schmuck,
Michael Giese and Shirley K. Knauer
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Functional disruption of the cancer-
relevant interaction between Survivin
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Funktionelle Inhibition der krebsrelevanten Interaktion von
Survivin und Histon H3 mit einem Guanidiniumcarbonylpyrrol-
Liganden
Cecilia Vallet*[a], Dennis Aschmann[b], Christine Beuck[c], Matthias Killa[b], Annika Meiners[a], Marcel
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Mertel[b], Martin Ehlers[b], Peter Bayer[c], Carsten Schmuck , Michael Giese*[b] and Shirley K. Knauer*[a]
†
In Gedenken an Prof. Dr. Carsten Schmuck (20.02.1968 – 01.08.2019)
Zusammenfassung: Das Protein Survivin ist bei den meisten
Krebsarten überexprimiert und gilt als einer der Hauptakteure der
Krebsentstehung. Wir haben einen supramolekularen Ansatz genutzt,
um Survivin als Wirkstoff-Ziel zu adressieren, indem wir die Protein-
Protein-Interaktion von Survivin und seinem funktionell relevanten
Bindungspartner Histon H3 inhibieren. Ligand L1 basiert auf dem
Guanidiniumcarbonylpyrrol-Kation und dient als hochspezifischer
Anionenbinder. Durch NMR-Titrationen konnte die Bindung von L1 an
die Histon H3-Bindungsstelle von Survivin bestätigt werden. Die
Hemmung der Survivin-Histon-H3-Interaktion und folglich eine
Verringerung der Proliferation von Krebszellen wurde durch
mikroskopische und zelluläre Assays nachgewiesen.
Survivin wird in fast allen malignen Tumoren überexprimiert und
gilt als früher diagnostischer sowie prognostischer Biomarker.[1]
Das Protein wurde mit einer Resistenz gegenüber Chemo- und
Abb. 1: Die Interaktion von Survivin (blau) und Histon H3 (grün) ist für Survivin
essentiell, um seine Rolle als Mitglied des Chromosomal Passenger Complex
Bestrahlungstherapien
sowie
einem
schlechteren
(CPC) in der Mitose zu erfüllen, der aus Survivin, Borealin (hellblau) und
AuroraB (grau) und INCENP (gelb) besteht. Der supramolekulare
Guanidiniumcarbonylpyrrol-Ligand L1 (türkis) wurde entwickelt, um die
Interaktion von Survivin und Histon H3 zu inhibieren und dadurch die
Proliferation von Krebszellen zu verringern.
Krankheitsverlauf in Verbindung gebracht.[2] Survivin ist an zwei
Schlüsselprozessen der Karzinogenese beteiligt: Als Mitglied der
Familie der Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAPs) wirkt es dem
Zelltod entgegen und fördert als Teil des Chromosomal
Passenger Complex (CPC) die Zellproliferation.[3] Da Survivin
hauptsächlich während der Embryonalentwicklung exprimiert wird,
jedoch kaum in ausdifferenzierten adulten Geweben, gilt es als
eines der krebsspezifischsten Proteine, die bisher bekannt sind.[4]
Survivin besitzt keine enzymatische Aktivität und stellt daher ein
schwierig anzugreifendes Wirkstoffziel dar. Bisherige Strategien
zur Inhibition des Proteins basieren auf Antisense-
Oligonukleotiden, siRNAs, small molecule-Inhibitoren, Gen- und
Immuntherapien. Allerdings findet bislang keiner dieser Ansätze
klinische Anwendung.[5] Unser Ziel war es einen Liganden zu
identifizieren, der spezifisch die Protein-Protein-Interaktion (PPI)
zwischen Survivin und seinem funktionell relevanten
Bindungspartner Histon H3 inhibiert. Vor zwanzig Jahren galten
PPIs noch als schwer zu adressieren, da PPI-Grenzflächen, im
Gegensatz zu tiefen Bindetaschen, an die typischerweise kleine
Moleküle binden, flach und großflächig sind.[6]
Seit Kurzem hat die Modulation von PPIs immer
vielversprechendere Ergebnisse gezeigt, da supramolekulare
Chemie sich als geeignete Methode zur Adressierung von
Proteingrenzflächen bewährt hat.[7,8] Das Design von Liganden,
die an einen genau definierten hotspot auf der Proteinoberfläche
binden, bleibt jedoch eine Herausforderung.[9]
Die bisher erfolgreichsten Ansätze verwendeten Verbindungen
mit spezifischen, gut charakterisierten Bindungsmotiven für
Aminosäuren und Peptide, um PPIs funktionell zu modulieren.[7]
Einige bekannte Beispiele sind Calixerene, die an Peptidschleifen
gebunden die Struktur von Antikörpern imitieren und so die
Interaktion von Cytochrom c und der Cytochrom c-Peroxidase
hemmen, Cucurbiturile, die verwendet wurden, um die
Dimerisierung von Proteinen zu induzieren und zu kontrollieren,
oder Lysin und Arginin-spezifische molekulare Pinzetten, die in
der Lage sind, die PPI zwischen 14-3-3 und seinen
Partnerproteinen C-Raf und ExoS zu inhibieren.[10] Bei unserem
Proof of Concept-Ansatz, wurde ein supramolekularer Ligand auf
der Basis des Guanidiniumcarbonylpyrrol-Kations (GCP)
entworfen , um die Interaktion zwischen Survivin und Histon H3
zu modulieren. Die Guanidinium-Einheit in Form von Arginin liegt
nicht nur in den aktiven Zentren vieler Enzyme als Bindestelle für
anionische Substrate vor, sondern hat sich auch als
ausgezeichnetes Bindungsmotiv in der supramolekularen
Chemie erwiesen.
[a]
[b]
[c]
Dr. C. Vallet, A. Meiners, Prof. Dr. S.K. Knauer
Lehrstuhl für Molekularbiologie II, Universität Duisburg-Essen
Universitätsstraße 5, 45141 Essen, Deutschland
E-Mail: cecilia.vallet@uni-due.de; shirley.knauer@uni-due.de
D. Aschmann, M. Killa, M. Mertel, Dr. M. Ehlers, Prof. Dr. C.
Schmuck, Prof. Dr. M. Giese
Institut für organische Chemie, Universität Duisburg-Essen
E-Mail: michael.giese@uni-due.de
Dr. C. Beuck, Prof. Dr. P. Bayer
Lehrstuhl für strukturelle und medizinische Biochemie, Universität
Duisburg-Essen
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O
Um die Bindung von L1 bestimmten Aminosäuren auf der
H
A
H2N
N
N
Proteinoberfläche
zuzuordnen,
führten
wir
NMR-
HN
O
H
O
NH2
NH2
O
Titrationsexperimente durch (Abb. 1A). Diese zeigten chemische
Verschiebungen bei Glutaminsäuren (E) 65 und 68,
Asparaginsäuren (D) 70, 71 und 72 und Glutaminsäuren (E) 75
und 76 (Abb. 3A). Diese Aminosäuren entsprechen der bereits
bekannten Histon H3-Bindestelle von Survivin, die die
Aminosäuren 51 bis 80 umfasst.[13] Darüber hinaus deutet die
H
NH
N
N
NH2
H
O
O
B
Abnahme
der
NMR-Signalintensitäten
auf
ein
Bindungsgleichgewicht mit einer Kinetik im mittleren Zeitbereich
(ms) hin, was einer Dissoziationskonstante im µM-Bereich
entspricht. Auch die relativen Intensitäten I / I0 zeigten eine
signifikante Abnahme im Bereich der Histon H3-Bindestelle von
Survivin, was ebenfalls auf eine Ligandenbindung innerhalb
dieser Region hinweist. Die Intensitäten nahmen für
Glutaminsäure (E) 68, Asparaginsäuren (D) 70, 71 und 72 und
Glutaminsäure (E) 75 stark ab (Abb. 3B).
A
B
Abb. 2: (A) Chemische Struktur des supramolekularen GCP-Liganden 1 (L1)
mit zwei Guanidiniumcarbonylpyrrol -Gruppen (blau). (B) Docking von L1
(türkis) an die Histone H3-Bindestelle von Survivin. Die gepunkteten Linien
(orange) zeigen Wechselwirkungen zwischen Ligand und Protein.
Interaktionsstellen des Liganden sind rot hervorgehoben.
Guanidinium-Gerüste wurden bereits verwendet, um künstliche
Rezeptoren
zu
entwickeln,
die
Oxoanionen
über
Wasserstoffbrücken sowie Ionenbindungen und hydrophobe
Wechselwirkungen binden können.[11] Das kationische
Guanidiniumcarbonylpyrrol (GCP) ist ein starres planares
Analogon mit überlegenen Bindungseigenschaften in wässrigen
Lösungsmitteln, die konkurrierende Anionen und Salze enthalten,
weshalb es sich für Anwendungen in einer zellulären Umgebung
eignet. Es wurde von uns bereits erfolgreich für das Design
künstlicher Rezeptoren für Aminosäuren, Oligopeptide oder
Oligonukleotide sowie für die Transfektion von DNA eingesetzt.[12]
Abb. 4: L1 reduziert die Interaktion von Survivin und Histon H3 in HeLa-Zellen.
(A) Die Immunpräzipitation zeigt eine konzentrationsabhängige Reduktion der
Survivin-Histon-H3-Interaktion durch L1. (B) Die quantitative Analyse des
Western Blots zeigt die Intensität des Histon-H3-Signals im Eluat, normalisiert
auf das jeweilige Survivin-HA-Signal in HeLa-Zellen, die entweder mit 10 µM L1,
50 µM L1 oder DMSO behandelt wurden (Kontrolle). Bei den Experimenten
handelt es sich um Triplikate. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des
Mittelwerts. Die Daten wurden mittels t-Test analysiert. Zwei Sternen (**)
entsprechen einen p-Wert von weniger als 0,01.
Um
Liganden
zu
identifizieren,
die
für
die
oberflächenexponierte anionische Histon H3-Bindestelle von
Survivin geeignet sind, führten wir Docking-Studien mit einer
fokussierten Bibliothek von Liganden durch, die eine oder zwei
GCP-Einheiten enthalten, um die negativ geladenen
Aminosäuren auf der Proteinoberfläche zu adressieren. Wir
haben verschiedene Linker getestet, um den Abstand zwischen
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass L1 mit der Histon H3-
Bindestelle von Survivin interagiert. Ob L1 von Zellen
aufgenommen wird und die Interaktion zwischen den beiden
Proteinen in einer zellulären Umgebung inhibieren kann, wurde
mit zwei verschiedenen Ansätzen überprüft. Zunächst führten wir
eine Co-Immunpräzipitation durch. Für diesen Assay wurden
HeLa-Zellen, bei denen es sich um Gebärmutterhalskrebs-Zellen
handelt, mit HA-markiertem Survivin transfiziert und mit
unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen oder der jeweiligen
Menge an DMSO als Kontrolle behandelt.
den
GCP-Einheiten
zu
variieren
und
die
beste
Bindungsorientierung zwischen Liganden und Zielaminosäuren
zu erzielen. Ligand 1 (L1) wurde hierbei als der Ligand mit dem
besten Docking-Score identifiziert (Abb. 2A und B).
A
B
Abb. 3: NMR-Titrationsexperimente bestätigten die Bindung von L1 an die
Histon H3-Bindestelle von Survivin. (A) Chemische Verschiebungen (CSP, ∆δ)
von 15N-markiertem Survivin 1-120 (300 µM) mit L1 (300 µM) im Vergleich zu
Protein ohne L1, aufgetragen gegen die Survivin-Sequenz. L1-bindende
Aminosäuren (AS) mit deutlichen Verschiebungen sind rot markiert. (B) Die
relativen Signalintensitäten zeigen eine signifikante Abnahme im Bereich der
Histon H3-Bindungsstelle von Survivin, was auf eine Ligandenbindung
innerhalb dieser Region hinweist (roter Pfeil). Die Histogramme in (A) und (B)
zeigen nur die Region um die H3-Bindestelle, für die vollständigen Diagramme
siehe Abbildung S1.
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Da die Western-Blot-Analyse nur als semi-quantitativ gilt und die
Co-Immunpräzipitation mit überexprimiertem und HA-markiertem
Survivin durchgeführt wurde, was nicht den natürlichen
Bedingungen in der Zelle entspricht, wurden die Ergebnisse mit
einem in situ Proximity Ligation Assay (PLA) überprüft. Der PLA
ermöglicht die Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen
innerhalb der Zelle auf endogener Ebene. Zunächst binden zwei
Primärantikörper an die Zielproteine Survivin und Histon H3.
Sekundärantikörper, die an ein Paar kurzer einzelsträngiger
Oligonukleotide gekoppelt sind, erkennen dann diese Antikörper.
Befinden sich die beiden Zielproteine in unmittelbarer Nähe
(<40 nm), hybridisieren und ligieren die Oligonukleotide mit zwei
zusätzlichen Konnektoroligonukleotiden und formen eine
zirkuläre DNA-Struktur. Die DNA-Polymerase amplifiziert die
zirkuläre DNA dann durch Rolling Circle-Amplifikation mit
fluoreszierenden Nukleotiden, die anschließend mittels
Fluoreszenzmikroskopie als PLA-Signale nachgewiesen werden
können. Auch der PLA zeigte eine signifikante Abnahme der
Survivin-Histon-H3-Interaktionen innerhalb der Zelle nach
L1-Behandlung und bestätigte dadurch die Ergebnisse der
Co-Immunpräzipitation (Abb. 5A und B).
A
B
Abb. 5: Die inhibierende Wirkung von L1 konnte mittels PLA bestätigt werden.
(A) Der PLA wurde in Hela-Zellen durchgeführt, die mit 50 µM L1 oder der
jeweiligen Menge an DMSO (Kontrolle) behandelt wurden. Ganze Zellen sind in
Magenta, DNA in Blau und PLA-Foci in Gelb dargestellt. Maßstabsbalken:
20 µm. (B) Quantifizierung des PLAs. Die Fehlerbalken zeigen den
Standardfehler des Mittelwerts. N> 55. Die Daten wurden mittels t-Test
analysiert. Ein Stern (*) entspricht einem p-Wert kleiner als 0,05.
Nach 24-stündiger Inkubation wurden Zelllysate hergestellt und
mit magnetischen HA-Antikörper-gekoppelten Beads inkubiert,
was die Elution von Survivin-HA zusammen mit allen an Survivin
gebundenen Proteinen, einschließlich Histon H3, ermöglichte.
Die Menge an an Survivin gebundenem Histon H3 wurde dann
mittels Western-Blot-Analyse quantifiziert. So konnte gezeigt
werden, dass L1 tatsächlich die Interaktion zwischen Survivin und
Da gezeigt werden konnte, dass L1 die Interaktion zwischen
Survivin und Histon H3 in der Zelle vermindert, wollten wir
untersuchen, ob der Inhibitor folglich auch die Rolle von Survivin
in der Zellproliferation beeinträchtigt. Daher wurden HeLa-Zellen
mit 50 µM L1 behandelt und synchronisiert, bevor sie während
der Mitose fixiert wurden. Anschließend wurden die Zellen mittels
Immunfluoreszenz gefärbt, um die mikroskopische Identifizierung
von mitotischen Defekten zu ermöglichen. Zellen, die mitotische
Defekte aufwiesen, wurden einer der fünf folgenden Kategorien
Histon H3
konzentrationsabhängig
reduziert.
Eine
Ligandenkonzentration von 10 µM führte bereits zu einer
Abnahme der Survivin-Histon-H3-Interaktion um 50%, während
eine Konzentration von 50 µM eine Abnahme von 65% bewirkte.
(Abb. 4A und B).
Abb. 6: L1 induziert mitotische
Defekte in HeLa-Zellen und hemmt
die Zellproliferation. (A) Anteil von
A
B
HeLa-Zellen
mit
mitotischen
Defekten, die 48 h mit 50 µM L1
behandelt wurden, im Vergleich zur
DMSO-Kontrolle.
Tortendiagramme zeigen die Anteile
der verschiedenen mitotischen
(C)
Defekte, die in L1-behandelten Zellen
im Vergleich zu DMSO-behandelten
Zellen gefunden wurden (Kontrolle).
N> 100. (C) HeLa-, A549-, MDA-MB-
231- und HCT-116-Zellen wurden mit
unterschiedlichen
Konzentrationen
Liganden-
DMSO
oder
behandelt und für 72 h inkubiert,
bevor die Zellproliferation mittels
MTS-Assay gemessen wurde. Die
Absorption bei 490 nm in L1-
behandelten Zellen wurde auf die
Absorption in DMSO-behandelten
Zellen des jeweiligen Zelltyps
(Kontrolle) normiert. Die Experimente
wurden in Triplikaten durchgeführt.
C
Die
Fehlerbalken
zeigen
den
Standardfehler des Mittelwerts. Die
Daten wurden mittels 1way ANOVA
analysiert, gefolgt von einem Tukey’s
Multiple Comparison-Test. Zwei
Sterne (**) entsprechen einem p-Wert
kleiner als 0,01. Drei Sterne (***)
einem p-Wert kleiner als 0,001.
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zugeordnet: Multipolare Pro-
/
Metaphase, multipolare
Um zu bestätigen, dass die beobachteten Auswirkungen der L1-
Ana- / Telophase, zurückbleibende Chromosomen, azentrische
Fragmente und Chromatinbrücken (Abb. S23).[14] Die
Experimente zeigten, dass L1 die Anzahl der mitotischen Defekte
in HeLa-Zellen drastisch erhöhte. Während nur 6% der
Kontrollzellen mitotische Defekte aufwiesen, erhöhte sich der
Anteil in mit Liganden behandelten Zellen auf 32% (Abb. 6A).
Darüber hinaus zeigten L1-behandelte Zellen im Vergleich zur
Kontrolle eine größere Vielfalt an mitotischen Defekten. Neben
azentrischen Fragmenten und zurückbleibenden Chromosomen
konnten auch Chromatinbrücken und multipolare Spindeln
beobachtet werden (Abb. 6B). Dies bestätigt, dass L1 mit den
mitotischen Funktionen von Survivin interferiert. Wir haben die
antiproliferativen Eigenschaften des Liganden quantifiziert, indem
wir Zellproliferationsassays in verschiedenen Arten von
Krebszellen durchgeführt haben: HeLa-Zellen, bei denen es sich
um Gebärmutterhalskrebs-Zellen handelt, A549-Zellen als Modell
für Lungenkrebs, MDA-MB-231-Zellen, bei denen es sich um eine
Brustkrebs-Zelllinie handelt und HCT-116-Zellen, die als Modell
für Darmkrebs dienen. Die für den Assay verwendete
Behandlung
auf
die
Proliferation
von
Krebszellen
Survivin-spezifisch sind, wurde ein Rescue-Experiment
durchgeführt, bei dem HCT 116-Zellen transient mit Survivin-HA
(Rescue) oder mit GFP (Kontrolle) transfiziert wurden. Nach
72-stündiger Behandlung der Zellen mit L1 wurde die
Zellproliferation mittels MTS-Assay gemessen. Wir konnten
beobachten, dass eine Überexpression von Survivin-HA die
antiproliferative Wirkung von L1 in allen getesteten
Konzentrationen nahezu vollständig aufhob. Während die
Zellproliferation in Kontrollzellen auf 72% (50 µM), 67% (100 µM)
und 55% (200 µM) verringert wurde, konnte die Zellviabilität in
Zellen, die Survivin-HA überexprimierten, auf 97% (50 µM), 89%
(100 µM) und 91% (200 µM) wiederhergestellt werden (Abb. 7).
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wirkung von L1
tatsächlich durch eine spezifische Inhibition von Survivin
verursacht wird.
Basierend auf einer fokussierten Bibliothek konnten wir L1
als vielversprechenden Liganden identifizieren, um die Protein-
Protein-Interaktion von Survivin und Histon H3 zu inhibieren. Die
Bindung des Liganden an die Histone H3-Bindungsstelle von
Survivin, die die Wechselwirkung mit Histone H3 in den frühen
Stadien der Mitose vermittelt und für die Zellproliferation von
entscheidender Bedeutung ist, konnte mittels NMR-Titration
verifiziert werden. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Interaktion
zwischen den beiden Proteinen in einer zellulären Umgebung
erfolgreich verringert wurde. Dies führte zu einer zunehmenden
Anzahl von mitotischen Defekten und folglich zu einer Survivin-
spezifischen Hemmung der Krebszellproliferation. Weitere
Studien konzentrieren sich nun auf die Entwicklung zusätzlicher
Liganden, um andere funktionell relevante Protein-Protein-
Interaktionen von Survivin zu inhibieren. Darüber hinaus wollen
wir Multivalenz nutzen, um L1 in Bezug auf Spezifität und Affinität
weiter zu verbessern und zu optimieren.
Tetrazoliumverbindung
[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-
carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)
wird von lebenden Zellen zu einem farbigen Formazan-Produkt
bioreduziert. Die bei 490 nm gemessene Absorption des
Formazan-Produkts ist direkt proportional zur Anzahl der
lebenden Zellen. Der Assay ergab, dass L1 die Zellproliferation in
allen getesteten Krebszelllinien erfolgreich reduzieren konnte
(Abb. 6C). In drei der vier Zelllinien konnte die Proliferation um
mehr als 30% verringert werden, was in etwa der gleichen
Größenordnung wie bei Survivin-depletierten Zellen entspricht [15]
.
Die
Hemmung
der
Zellproliferation
erfolgte
konzentrationsabhängig wobei die größten Effekte in der
Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 sowie der Darmkrebszelllinie
HCT 116 beobachtet werden konnten.
Experimenteller Abschnitt
Alle experimentellen Details finden Sie in der Supporting
Information.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Sonderforschungsbereich 1093 (SFB
1093) der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert.
Mikroskopische Analysen wurden in Zusammenarbeit mit dem
Imaging Center Campus Essen (ICCE) durchgeführt.
Abb. 7: Die Überexpression von Survivin-HA hebt die antiproliferative Wirkung
von L1 in HCT 116-Zellen auf und bestätigt damit, dass die beobachteten
Effekte des Liganden Survivin-spezifisch sind. HCT 116-Zellen wurden transient
mit Survivin-HA (Rescue) oder GFP (Kontrolle) transfiziert und 72 h mit
unterschiedlichen L1-Konzentrationen behandelt. Die Zellproliferation wurde
mittels MTS-Assay gemessen. Die Experimente wurden als Triplikate
durchgeführt. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts. Die
Daten wurden mit einem 1way ANOVA analysiert, gefolgt von einem Tukey’s
Interessenskonflikt
Die Autoren deklarieren keinen Interessenkonflikt.
Multiple Comparison-Test. Ein Stern (*) entspricht einem p-Wert kleiner als 0,05.
Zwei Sterne (**) entsprechen einem p-Wert kleiner als 0,01 und drei Sterne (***)
einem p-Wert kleiner als 0,001.
Schlüsselwörter: Supramolekulare Chemie
Erkennung Survivin PPI-Inhibitor
•
•
Molekulare
Krebs •
•
•
Guanidiniumcarbonylpyrrol • NMR • Konfokale Mikroskopie •
Apoptose • Wirkstoffentwicklung • Inhibitoren
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10.1002/anie.201915400
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Der supramolekulare
Cecilia Vallet, Dennis Aschmann,
Matthias Killa, Annika Meiners,
Christine Beuck, Marcel Mertel,
Martin Ehlers, Peter Bayer, Carsten
Schmuck, Michael Giese and
Shirley K. Knauer
Guanidiniumcarbonylpyrrolligand L1
bindet die Histon H3-Bindungsstelle
des Proteins Survivin, das in
Krebszellen überexprimiert wird. Die
Inhibition der Interaktion von
Survivin und Histon H3 reduzierte
erfolgreich die Proliferation von
Krebszellen.
Page No. – Page No.
Funktionelle Inhibition der
krebsrelevanten Interaktion von
Survivin und Histon H3 mit einem
Guanidiniumcarbonylpyrrol-
Liganden
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