2 Anilino 1,3,4 thiadiazole derivatives as inhibitors of oxidative and photosynthetic phosphorylation

Full text of DOI:10.1515/znc-1975-3-408

2-Anilino-1.3.4-thiadiazole, Hemmstoffe der oxidativen
und photosynthetischen Phosphorylierung
2-Anilino-l,3,4-Thiadiazoles, Inhibitors of Oxidative and Photosynthetic
Phosphorylation
G. Schäfer *
Medizinische Hochschule Hannover, Department Biochemie
A. Trebst
Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, Ruhr-Universität Bochum
K. H. Büchel
Bayer AG, Forschungszentrum, Wuppertal
(Z. Naturforsch. 30 c, 183 —189 [1975] ; eingegangen am 19. Dezember 1974)
Oxidative Phosphorylation, Photophosphorylation, Uncouplers, Structure-function Correlation
2-anilino-l,3,4-thiadiazoles carrying various substituents in the 5-position as well as in the
benzene-ring were synthesized.
The compounds were tested with rat-liver-mitochondria and with spinach-chloroplasts and revealed
to be potent uncouplers of both, oxidative and photosynthetic phosphorylation, with pl50-values
rangeing from 6.79 to 4.05. At higher concentration all compounds are inhibitors of the Hill-
reaction.
In mitochondria
a fair correlation exists between pKa of the acidic NH-group and the un-
coupling activity; a maximum is obtained around pKa= 6.8, whereas in chloroplasts activity is
shifted to more acid pKa-values.
The compounds meet the requirements for uncouplers according to the chemi-osmotic theory,
being lipophilic weak acids. N-methylation causes total loss of activity in mitochondrial oxidative
phosphorylation.
The inhibitory action on photosynthetic electron transport is located within photosystem II. This
latter activity is almost independent of substituent effects in contrast to uncoupling of either
respiratory- or photo-phosphorylation.
Einleitung
sich Verbindungen der allgemeinen Formel 1 er-
geben :
Gemeinsames strukturelles Merkmal zahlreicher
Effektoren der biologischen Energiekonservierung
in Photosynthese und Zellatmung ist eine azide NH-
Gruppe in einem lipophilen Grundmolekül. Dies gilt
insbesondere für die Hemmstoffe des photosyntheti-
schen Elektronentransportes im Bereich von Photo-
system II bzw. für Entkoppler der oxidativen Phos-
phorylierung. Wir konnten dies an einer Reihe
von rc-Überschuß-Heterocyclen feststellen, im erste-
ren Fall bei Benzimidazolen1-3, Imidazolen2 4, Py-
rido-imidazolen4, Purinen4 und Triazolen4 sowie
im letzteren bei Hydrazonen5 und 2-Anilino-thio-
phenen 6.
R = CF3 , —C(CH,).
X = CI, N 0 2, CF3
n = 2,3
Die 2-Anilino-1.3.4-thiadiazole sind zum Teil be-
trächtlich azid (pK 4,3 —8,9) und zeigen die erwar-
teten Eigenschaften als Entkoppler und als Hemm-
stoffe des photosynthetischen Elektronentransportes.
Ihre Eigenschaften als Entkoppler in der Energie-
konservierung in der Atmungskette sollen denen in
der Photosynthese gegenübergestellt werden, da ne-
ben den aus dem Wirkungsprinzip ableitbaren Ana-
logen auch gegensätzliche Effekte in beiden Syste-
men auftreten.
Um zu neuen aciden N-substituierten Anilinen zu
gelangen, wurden als N-Substituenten negativ bzw.
lipophil substituierte Thiadiazolreste gewählt, so daß
Requests for reprints should be sent to Prof. Dr. G.
Schäfer, Department Biochemie, Medizinische Hochschule,
D-3000 Hannover, Karl-Wiechert-Allee 9.
* G. Schäfer dankt Frl. Claudia Wegener für die ausge-
zeichnete technische Assistenz.
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184
G. Schäfer et cd. • Oxidative und Photo-Phosphorylierung
Darstellung von 2-Anilino-1.3.4-thiadiazolen
Extinktionsmessung. Dadurch wird ein durch die
nicht vollständig entfernbare Trübung hervorgeru-
fener Extinktionsanteil erfaßt, der vom Meßwert ab-
gezogen wird. Das Verfahren wird mit Labtrol®
Standardserum geeicht.
Die Entkoppler wurden den atmenden Mitochon-
drien als alkoholische Lösung zugesetzt. Der Zusatz
von entsprechenden Mengen Äthanol allein ist auf
die Atmung von Mitochondrien ohne Einfluß.
Die Chloropiasten (gewaschene Thylakoidpräpa-
ration) wurde nach Nelson et al. 12 hergestellt. Ihre
photosynthetische Aktivität wurde durch Belichtung
bei 15 °C mit 30 000 lx für 10 min festgestellt. Das
Reaktionsmedium enthielt je 3 ml Ansatzvolumen in
/«nol: Tricinpuffer (pH 8), 160; MgCl2, 10; ADP,
10; anorganisches Phosphat, 10 mit 90 000 cpm 32P
und Chloroplasten mit 0,2 mg Chlorophyll. Zur Mes-
sung der cyclischen Photophosphorylierung wurden
0.3 /tmol PMS (Phenazin-methosulfat) unter N2
und in der Hill-Reaktion 0,1 //mol Anthrachinon-2-
sulfonsäure unter Luft zugesetzt. Die gebildete
Menge ATP wurde durch den Einbau von 32P nach
Conover et al. 13 bestimmt, die Elektronentransport-
rate in der Hill-Reaktion (pseudocyclischer e-Trans-
port) durch die aufgenommene Menge Sauerstoff.
Für Anilino-thiadiazole sind in der Literatur eine
Reihe von Verfahren angegeben, z. B. durch oxida-
tive Behandlung von Thiosemicarbazonen bzw.
durch intramolekulare Kondensation von l-Acyl-4-
aryl-thiosemicarbaziden 7.
Wir stellten die hochsubstituierten Anilino-thia-
diazole 1 —16 (Tab. I) durch N-Alkylierung von
2-Amino-1.3.4-thiadiazolen8,9 mit aktivierten Chlor-
benzolen in Gegenwart von Basen her.
n ---------n
♦ HCl
CI
\
-
I
■
V ,
R
Vi-Q,
1-14
Man führt die Reaktion in Lösungsmitteln wie
Methanol oder Butanol durch. Im IR-Spektrum sind
für die 2-Anilino-1.3-4-thiadiazole die starke CH-
Bande des substituierten Phenylringes bei ca. 3100/
cm sowie NH-Bande bei ca. 3250 —3300/cm charak-
teristisch.
Die Verbindungen sind z.T. gelb bis orangerot
oder gelbbraun gefärbte Substanzen, unlöslich in
Wasser und wenig löslich in siedenden, niedrigen
Alkoholen.
Beschreibung der chemischen Synthesen
Mitbearbeitet von K. Bungarz
ci
1. Ausgangsprodukte
Die Ausgangsverbindungen 2-Amino-5-trifluor-
methyl-1.3.4-thiadiazol und 2-Amino-5-ferf-butyl-
1.3.4-thiadiazol werden nach bekannten Verfahren
durch Umsetzung von Thiosemicarbazid mit T ri-
fluoressigsäure bzw. Pivalinsäure erhalten 8) 9.
Die 2-Anilino-1.3.4-thiodiazole 1 —14 können
mit Diazomethan zu den 2-(N-Methylanilino)-1.3.4-
thiadiazolen methyliert werden10. 15 und 16 sind
die N-Methylderivate der Verbindungen 1 bzw. 9
und wurden synthetisiert, um auch bei der neuen
Substanzklasse den früheren Befund zu prüfen, daß
bei NH-aziden Hemmstoffen die N-Substitution zum
Wirkungsabfall fü h rtlj 4>10.
2-Amino-5-trifluormethyl-1.3.4-thiadiazol
Ein Gemisch aus 643 g Polyphosphorsäure und
425 g (3,73 mol) Trifluoressigsäure wird auf 60 °C
erwärmt. 272 g (3 mol) Thiosemicarbazid werden
portionsweise hinzugegeben. Die Temperatur steigt
dabei auf 75 °C an. Nach beendeter Zugabe wird
langsam auf 105 °C erhitzt und bei dieser Tempera-
tur 2 Stunden nachgerührt. Das Reaktionsgemisch
wird anschließend auf 5 1 Eiswasser gegeben. Dabei
fällt ein farbloser Feststoff aus. Dieser wird abge-
saugt und mit ca. 101 Wasser säurefrei gewaschen.
Das Produkt wird getrocknet. Man erhält 360 g
(71% der Theorie) 2-Amino-5-trifluormethyl-1.3.4-
thiadiazol 8 vom Schmelzpunkt 219 —221 °C.
Material und Methoden
Mitochondrien wurden aus Rattenleber nach den
bekannten Verfahren der Differentialzentrifugierung
in isotonischer Saccharoselösung hergestellt. Die
Atmungsgröße mit verschiedenen Substraten wurde
polarographisch gemessen, wie früher beschrieben 6.
Der Proteingehalt der Partikelsuspensionen wurde
nach einer modifizierten Biuretmethode 11 bei 546 nm
gemessen; die Modifikation besteht in einer Entfär-
bung des Kupferkomplexes durch überschüssiges
Cyanid in Probe und Blindwert mit nochmaliger
2-Amino-5-ferZ-butyl-1.3.4-thiadiazol
Ein Gemisch aus 322 g Polyphosphorsäure und
190 g (1,87 mol) Pivalinsäure wird auf 65 °C er-
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G. Schäfer et al. • Oxidative und Photo-Phosphorylierung
185
hitzt. 136 g (1,5 mol) Thiosemicarbazid werden
portionsweise hinzugegeben. Die Temperatur steigt
dabei auf 67 °C an. Nach beendeter Zugabe wird
langsam auf 105 °C erwärmt und bei dieser Tem-
Die analytischen Daten dieser beiden Verbindun-
gen sind in Tab. I enthalten.
Ergebnisse
peratur
2 Stunden nachgerührt. Das Reaktions-
gemisch wird anschließend auf 5 1Eiswasser gegeben.
Hierbei bildet sich ein zähes öl. Nach Neutralisation
mit wäßriger NH3-Lösung erhält man einen Fest-
stoff. Dieser wird abgesaugt, mit 101 Wasser gewa-
schen und getrocknet. Nach Auskochen mit 2 1 Li-
groin bildet sich ein grüner Feststoff. Man erhält
88 g (37,5% der Theorie) 2-Amino-5-Zerf-butyl-
1.3.4-thiadiazol 9 vom Schmelzpunkt 180—182 °C.
Als Kriterium für das Ausmaß der Entkopplung
wurde die Methode des sogenannten „state-3 release“
gewählt. Dabei wird die Atmung durch Abwesenheit
eines Phosphatakzeptors (ADP) im kontrollierten
Zustand gehalten und kontinuierlich registriert. Zu-
satz von Entkoppler führt zu einer der Aktivität des
Entkopplers entsprechenden Aufhebung dieser Kon-
trolle und daher zur Beschleunigung der Sauerstoff-
aufnahme. Dieser Vorgang ist konzentrationsabhän-
gig und erlaubt eine Titration mit Entkoppler, wie
früher gezeigt 6. Die Effektivität wird im pI50-Wert
als negativer Logarithmus der halbmaximalen Wirk-
konzentration ausgedrückt. Bei über die maximale
Aktivierung der Atmung hinausgehenden Konzen-
trationen führen alle Entkoppler zu einer sukzessi-
ven Atmungshemmung. Diese wird hier nicht näher
diskutiert; sie setzt sich aus einer teilweisen, für
niedrige Konzentrationen vernachlässigbaren Hem-
mung des Elektronentransportes in der Atmungs-
kette und aus einer bei erhöhten Konzentrationen
auftretenden kompetitiven Hemmung der Aufnahme
von Substratanionen zusammen 5’21>22.
2. 2-Anilino-l .3.4-thiadiazole
2- (2,-Chlor-4,.6,-dinitro-anilino) -5-trifluormethyl-
1.3.4-thiadiazol (Verb. 1 in Tab. I)
23,7 g 1.2-Dichlor-4.6-dinitro-benzol und 2-
Amino-5-trifluormethyl-1.3.4-thiadiazol werden in
300 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von 31ml
24-prozentiger wäßriger Natronlauge wird das Re-
aktionsgemisch 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt. Da-
nach wird auf 20 °C abgekühlt und mit 10-prozenti-
ger Salzsäure versetzt, bis ein pH-Wert von 3 er-
reicht ist. Dabei fällt das Produkt als gelber Fest-
stoff aus, welcher abgesaugt, mit 2 1 Wasser gewa-
schen und anschließend getrocknet wird. Man er-
hält 31.8 g (86% der Theorie) 2-(2/-Chlor-4/.6/-di-
nitro-anilino) -5-trifluormethyl-1.3.4-thiadiazol vom
Schmelzpunkt 192 —193 °C. UV : -2max 306 nm; log e
= 4,98.
Tab. II gibt eine Zusammenfassung der pl50-
Werte für alle Verbindungen aus Tab. I. Die pI5o-
Werte für die Entkopplung der oxidativen Phospho-
rylierung sind dabei denen in der Photophosphory-
lierung und der Hill-Reaktion gegenübergestellt.
Die analytischen Daten sind mit weiteren Beispie-
len 2 —14 in Tab. I aufgeführt.
3. 2-(N-M ethylanilino)-1.3.4-thiadiazole
2- (2/-Chlor-4/.6,-dinitro-N-methylanilino) -5-trifluor-
methyl-1.3.4-thiadiazol (Verb. 15 in Tab. I)
1. Photophosphorylierung und Photosynthese
In den photosynthetischen Systemen sind die ge-
testeten Anilino-thiadiazole sowohl Hemmstoffe des
Elektronentransportes als auch der Photophosphory-
lierung (letzteres in einem cyclischen System gemes-
sen, das nur Photosystem I benötigt). Dabei sind im
Falle der CF3 substituierten Anilino-thiadiazole ge-
ringere Konzentrationen für die Hemmung der
Photophosphorylierung als für die des Elektronen-
transportes notwendig. Bei den ferf-Butyl-substitu-
ierten Thiadiazol-derivaten ist dagegen meist die
Hemmung des Elektronentransportes ausgeprägter.
Wie in Mitochondrien sind also die Trifluormethyl-
derivate wesentlich bessere Hemmstoffe der Photo-
phosphorylierung als die ferf-Butyl-derivate.
Zu 9,5 g (0,0257 mol) 2-(2,-Chlor-4/.6,-dinitro-
anilino)-5-trifluormethyl-1.3.4-thiadiazol, gelöst in
200 ml abs. Äther, wird soviel ätherische Diazo-
methanlösung hinzugegeben, bis die N2-Entwicklung
beendet ist. Überschüssiges Diazomethan wird durch
Zugabe verdünnter Salzsäure zersetzt. Die ätherische
Phase wird abgetrennt und über Na2S04 getrocknet.
Der Äther wird am Rotationsverdampfer abgezogen
und das zurückbleibende Öl mit 100 ml Diisopropyl-
äther ausgerührt.
Es entsteht ein gelber Feststoff. Man erhält 4,0 g
(40,6% der Theorie) 2-(2/-Chlor-4/.6/-dinitro-N-
methylanilino) -5-trifluormethyl-1.3.4-thiadiazol vom
Schmelzpunkt 97 °C. NMR: $CH3= 3,75 ppm.
Analog wird das 2-(2/-Chlor-4,.6/-dinotro-N-
Die Abhängigkeit der Hemmwirkung von der
Substitution zeigt eine Erhöhung der Wirksamkeit
methylanilino) -5-terf-butyl-1.3.4-thiadiazol
(Verb.
16 in Tab. I) erhalten. Schmelzpunkt 129 —131 °C.
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186
No.
G. Schäfer et al. • Oxidative und Photo-Phosphorylierung
R
X
n
Schmp.
[°C]
(Mol-
Bruttoformel
pKa
Analyse
gewicht)
C
H
N
1
2
CFg
2-C1,
4.6-N 02
3
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
1 9 2 -1 9 3
12 9 -1 3 1
2 0 5 -2 0 7
1 7 1 -1 7 2
1 9 6 -1 9 8
193
Ber.
Gef. 29.3
5,55
6,8
C9H3C1F3N50 4S (369,7)
29.3
0,81
1,1
1,19
1,2
19,0
19,6
c f 3
2.4-NOz
Ber.
Gef.
c9h 4f 3N 5O 4s
c 9h 3f 3N 6O 6s
c 9h 3c if3N 5O 4s
ciOh3f6N50 4s
ciOh3f6N50 4s
c 12h 10f 3N 5O 4s
ciOh6f3N50 4s
c 12h 12c iN 5O 4s
c 12h 12c iN 5O 4s
c 13h 15N 5O 4s
(335,2)
(380,2)
(369,7)
(403,2)
(403,2)
(377,3)
(347,2)
(357,8)
(357,8)
(337,2)
(323,3)
(365,4)
(391,3)
32.3
27.3
20,9
17,0
3
c f 3
2.4.6-N02
4,35
6,15
5,3
Ber. 28,5
Gef. 28,3
0,79
1,3
22,1
22,2
4
c f 3
3.5-N02 ,
4-C1
Ber.
Gef.
29,3
29,5
0,81
1,5
0,75
1,40
19,0
18,7
5
c f 3
2.6-N O ,,
4-CF3
Ber.
Gef.
29,8
29,4
17,35
17,8
2-CF3 ,
4.6-N 02
6
c f 3
4,9
Ber. 29,8
Gef. 29,7
0,75
1,3
17,35
17,3
Ber. 38,3
Gef. 38,6
2.4-N02,
6-CH (CH3),
1 8 4 -1 8 5
1 8 2 -1 8 3
1 7 2 -1 7 5
116
6,5
2,66
2,9
18,6
18,8
7
c f 3
Ber. 32,1
Gef. 34,6
6,7
1,78
2,0
20,8
20,1
8
c f 3
2.4-N O,,
6-CH3
7,15
8,65
8,8
Ber. 40,3
Gef. 41,8
3,4
3,6
19,7
19,5
-C (C H 3) 3
-C (C H 3) 3
-C (C H 3) 3
-C (C H 3) 3
-C (C H s) 3
- c ( c h 3) 3
2-CI,
4.6-NO,
9
Ber. 40,3
Gef. 40,9
3.4
3.5
19.7
19.8
4-C1,
2.6-NO,
10
11
12
13
14
Ber.
Gef. 48.3
46.3
4,46
4,6
20,8
20,2
1 8 5 -1 8 6
1 2 4 -1 2 6
1 7 8 -1 8 0
1 1 7 -1 2 0
2-CH3 ,
4.6-N 02
Ber. 44,6 4,06
Gef. 45,8 4,1
21,7
22,0
c 12h 13N 5O 4s
8,9
2.4-N02
Ber. 49,4
Gef. 50,3
19,2
19,0
5,25
5,1
8,7
c 15h 19N 5O 4s
2-CH(CH3) 2 ,
4.6-NO,
c 13h 12f 3N 5O 4s
Ber. 40,0
Gef. 39,4
17,9
18,0
7,3
3,1
3,6
2.6-N O ,,
4-CF3
c 10h 5c if3N 5O 4s
c 13h 14c iN 5O4s
Ber.
Gef. 31.5
31.4
1,31
1,7
3,81
3,9
18,3
18,8
(383,7)
(371,5)
97
12 9 -1 3 1
-
N-Methylderivat von No. 1
N-Methylderivat von No. 9
15
16
Ber. 42,1
Gef.
18,85
18,6
—
42,3
Tab. II. pI50-Werte der 2-Anilino-thiadiazole als Entkoppler
in Mitochondrien und Chloropiasten und als Hemmstoffe
der photosynthetischen Sauerstoffentwicklung.
bei Einführung von CF3 oder CI in o rth o -, aber
nicht in para-Stellung des Anilinteils. Bei Vergleich
mit den pK-Werten der Substanz ergibt sich, daß
Substanzen mit pK-Werten oberhalb pK 7 schlechte
Entkoppler der Photophosphorylierung sind. Auf
die Instabilität der Substanzen muß hingewiesen
werden. Bei Inkubation der Substanzen im Reak-
tionsmedium für wenige Minuten tritt bereits ein
deutlicher Abfall der Hemwirkung ein. Dies bringt
es aus methodischen Gründen mit sich, daß die Ent-
kopplung der nicht cyclischen Photophosphorylie-
rung praktisch nicht erfaßt werden kann. Die Werte
der Tab. II sind durch Messung der Hemmung der
cyclischen Photophosphorylierung erhalten worden.
Bei der Hemmung des Elektronentransportes
wird fast keine Abhängigkeit der Wirksamkeit von
Substanz
No.
PI50
Hill Reakt.
P^so
photophos.
PI50
ox. phos.
5,87
5,75
5,89
5,87
5,92
5,92
5,98
5,85
5,66
5,04
5,04
4,91
5,45
5,70
6,79
6,62
6.68
5,72
6,53
7,30
6,25
5,85
4.78
4.05
4.26
4.99
4.96
4.82
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
6,13
7,43
4,88
6,65
5,06
5,48
7,10
6,92
6,77
5,20
5,30
5,66
6,07
6,52
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und Photo-Phosphorylierung
187
G. Schäfer et al. • Oxidative
Abb. 1 dargestellt. Zwischen pKa = 4 und pKa = 7
ergibt sich eine praktisch linear ansteigende Kor-
relation für die vorliegenden Derivate. In diesem
Bereich findet ein Anstieg der Aktivität um mehr als
zwei Größenordnungen statt. Hingegen bilden die
der Struktur beobachtet. Wie Tab. III zeigt, ist die
hemmung des photosynthetischen Elektronentranspor-
tes im Bereich von Photosystem II lokalisiert, weil
ein künstliches Donorsystem für Photosystem
I
(DAD/Ascorbat als Donor) nicht gehemmt wird.
Damit verhalten sich die Anilino-thiadiazole, wie er-
wartet, analog den vielen bekannten Hemmstoffen
von Photosystem II. Natürlich bleibt in einer Photo-
reduktion mit Photosystem I allein die Hemmung
der gekoppelten ATP-Bildung bestehen. Die Ver-
suche sind weiterhin eine Kontrolle dafür, daß bei
der Charakterisierung der Hemmpotenz als Entkopp-
ler in der cyclischen Photophosphorylierung sich
keine Hemmung des Elektronentransportes über-
lagert hat.
Tab. III. Lokalisation der Hemmstelle im photosyntheti-
schen Elektronentransport.
«mol 0 2
aufgenommen
^mol ATP
gebildet
Abb. 1. Korrelation von pKa und Entkoppleraktivität der
2-Anilino-1.3.4-thiadiazole an Lebermitochondrien der Ratte;
für den linearen Teil gilt: pI50= l,64 + 0,76 pKa (r=0,86).
Kontrollansatz
10~5 Substanz 2
IO-5 M Substanz 2 + DAD
1,5 x 10~5 Substanz 9
- 6 ,9
<0,1
- 7 ,3
- 0 ,3
- 6 ,4
<0,1
0,5
m
Derivate mit pK-Werten über 8 eine Gruppe mit
signifikant verminderter Aktivität. Für den Zusam-
menhang von pKa und Aktivität zeichnet sich daher
für die vorliegenden Beispiele ein Wirkungsmaxi-
mum im Bereich von pKa-Werten um 7 ab. Dies
unterstreicht die wesentliche Beteiligung des Anions
am Mechanismus der Entkopplung der mitochondria-
len Atmungskette.
m
<0,1
1,5 x 10“ 5 M Substanz 9
+ DAD
- 7 ,4
3,7
Pseudocyclischer Elektronentransport mit 0,1 /^mol Anthra-
chinon-2-sulfonsäure als Akzeptor. Das Reaktionsmedium
enthielt 10 /<mol Na-ascorbat. Zugabe von 10—4 mol DAD =
Diaminodurol als künstlicher Elektronendonor für Photo-
system I.
Ein Vergleich der CF3-substituierten mit den tert-
Butyl-substituierten Thiadiazolen zeigt, daß die CF3-
Verbindungen deutlich aktiver sind. Der mittlere
pI50-Wert liegt für diese bei 6,2, für die terf-Butyl-
derivate bei 5,9. Unter den letzteren befinden sich
auch alle Verbindungen mit pKa-Werten über 8.
2. Oxidative Phosphorylierung
Die 2-Anilino-1.3.4-thiadiazole sind nach den
heutigen Vorstellungen als schwache lipophile Säu-
ren „klassische“ Entkoppler im Sinne der Mitchell-
Theorie 14. Dabei bestimmen die Substituenten ne-
ben der Azidität auch die Lipophilität des Moleküls
sowie die Stabilität des Anions in der apolaren
Membranphase. In einer umfassenden Studie der
Dicyano-Carbonyl-phenylhydrazone 5 konnte gezeigt
werden, daß eine Stabilisierung des Anions durch
„hydrophobic shielding“ einen wesentlichen Beitrag
zur Entkopplerwirksamkeit liefert.
Die Anzahl der hier untersuchten Derivate reicht
für eine detaillierte Struktur-Wirkungskorrelation
nicht aus; auch ist die Variation der Substituenten,
welche sterische Merkmale und Lipophilität stark be-
einflussen, nicht breit genug. Daher überwiegt hier
der Einfluß des pKa und es läßt sich eine deutliche
Abhängigkeit zwischen pKa und der Wirkung auf
die oxidative Phosphorylierung erkennen, wie in
Bei einer Gegenüberstellung von pKa-Werten und
biologischer Wirksamkeit von Entkopplern sollte
berücksichtigt werden, daß pKa-Werte in Wasser
sicher signifikant von denjenigen membranadsor-
bierter Moleküle abweichen. Zwar wurden die hier
angegebenen pKa-Werte in einem Medium geringe-
rer Dielektrizitätskonstante, nämlich Alkohol/Was-
ser, ermittelt; sie können jedoch in der Grenzschicht
zwischen Lipidphase und wäßriger Lösung, also an
der Membranoberfläche beträchtlich verschoben sein.
Montal und Mitarbeiter 15 haben gezeigt, daß hier-
bei die Oberflächenladung der adsorbierenden Mem-
bran selbst eine wesentliche Rolle spielt und zu pKa-
Verschiebungen bis zu 2 führt. Mit pKa-Werten, die
in Lipid-adsorbiertem Zustand ermittelt wurden,
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G. Schäfer et al. • Oxidative und Photo-Phosphorylierung
sollte sich daher eine bessere Korrelation der mole-
kularen Parameter und der biologischen Aktivität
ergeben *.
wird 16. Da der energieabhängige Wasserstoffionen-
transport in Mitochondrien in umgekehrter Richtung
wie in Thylakoiden erfolgt, ist deren internem
Kompartiment das cytoplasmatische Kompartiment
der aeroben Säugerzelle mit höheren endogenen
pKa-Werten gegenüberzustellen. Dementsprechend
wurden die Experimente mit Mitochondrien bei pH
7,2 durchgeführt. Bei diesem pH liegt im Falle der
stark sauren Spezies die Konzentration des undisso-
ziierten Entkopplers möglicherweise zu niedrig, um
die Funktion eines H+-carriers in der Membran aus-
reichend zu erfüllen. Für diese Derivate ist daher
in Mitochondrien eine gegenüber Chloroplasten
schwächere Wirksamkeit verständlich. Der Unter-
schied zwischen den stärker sauren CF3-Derivaten
und den ZerZ-Butylderivaten ist an Chloroplasten
noch ausgeprägter als an Mitochondrien. Für die
Summe der CF3-Derivate beträgt der mittlere plso*
Wert 6,34 (n = 8), während der Wert für die tert-
Butylderivate mit p l50= 4,89 (n = 6) um mehr als
eine Größenordnung darunter liegt.
Die Anilino-thiadiazole zeigen mit ihrem zwei-
fachen Einfluß auf die photosynthetische Elektronen-
transportkette: Entkoppler und Hemmstoff, die
gleiche Wirkung wie die Carbonylcyanidphenyl-
hydrazone 17. Sie sind bei niedrigen Konzentrationen
(im Falle CF3 substituierter Verbindungen) Entkopp-
ler, bei höheren Hemmstoffe des Elektronentrans-
portes. Letztere Hemmstelle kann im Bereich von
Photosystem II lokalisiert werden. Die Strukturfor-
mel der Substanzen zeigt dann auch das übliche, für
solche Hemmstoffe geforderte, aktive Struktur-
element 18_20, eine NH-Gruppe, gebunden an ein sp2-
hybridisiertes C-Atom.
D iskussion
Ein Vergleich der Aktivität von Entkopplern der
oxidativen Phosphorylierung mit ihrer Aktivität in
Chloroplasten ist in Tab. IV gegeben. Die Derivate
wurden nach abnehmender Entkopplerwirksamkeit
an Lebermitochondrien angeordnet und ihre rela-
Tab. IV. Vergleich der relativen Entkoppleraktivitäten von
2-Anilino-thiadiazolen an Mitochondrien und Chloroplasten.
Phosphorylierung
oxidat.
Phosphorylierung ,Q ‘
Photo-
ox. phos. /
photo-phos.
No.
pl50 rel.
p l50 rel.
PI50
plso
6,62
6,25
5,85
4,78
5,72
4,82
6,79
4,96
4,99
7,30
4,26
4,05
6,53
6,68
0,91
0,86
0,80
0,65
0,78
0,66
0,93
0,68
0,68
1,00
0,58
0,55
0,89
0,91
1,12
1,14
1,18
1,42
1,16
1,35
0,90
1,22
1,13
0,75
1,24
1,28
0,77
0,73
2
7
8
9
4
14
1
13
12
6
11
1«
5
1,0
7,43
7,10
6,92
6,77
6,65
6,52
6,13
6,07
5,66
5,48
5,30
5,20
5,06
4,88
0,95
0,93
0,91
0.89
0,87
0,82
0,81
0,76
0,73
0,713
0,698
0,678
0,656
3
tive Wirkung durch Bezug auf die aktivste Verbin-
dung normiert (relat. Aktivität = 1 ) . Dem ist die
aus den entsprechenden pI50-Werten ermittelte rela-
tive Aktivität auf das System der Photophosphory-
lierung gegenübergestellt. Der Quotient „Q“ aus bei-
den relativen Aktivitäten zeigt an, auf welches der
beiden Systeme eine Verbindung die jeweils stär-
kere Wirkung ausübt. Es zeigt sich, daß 10 von 14
Derivaten in Mitochondrien stärker als in Chloro-
plasten entkoppeln. Innerhalb der Reihenfolge der
relativen Aktivitäten erscheinen für die verglichenen
Systeme nur fünf Verbindungen in gleicher Sequenz.
Es fällt jedoch auf, daß die vier in Mitochondrien
relativ schwächer entkoppelnden Derivate diejenigen
mit den niedrigsten pKa-Werten sind. Daraus ist
ersichtlich, daß das Wirkungsmaximum in Chloro-
plasten gegenüber Mitochondrien zu saueren pH-
Werten verschoben ist; eine Tatsache, die mit dem
internen pK des belichteten Chloroplasten Zusam-
menhängen könnte, der mit 6,0 —6,5 angegeben
Wie auf Grund früherer Untersuchungen zu er-
warten, sind die N-Methylderivate als Entkoppler
der oxidativen Phosphorylierung inaktiv (vgl.
Tab. V). Dies gilt auch für die Entkopplung der Photo-
phosphorylierung und wird durch N-Methylierung
der sehr aktiven Verbindung 1 besonders deutlich
Tab. V. Einfluß der N-Methylierung auf die Hemmaktivität
von 2-Anilino-thiadiazolen.
Substanz
No.
PI50
Hill-Reakt.
PI50
ox. phos.
PI50
photo-phos.
6,79
5,87
1
6,13
N-Methylderivate
inaktiv
6,77
4,48
4,78
4,48
5,66
von 1 (= 15)
9
N-Methylderivat
von 9 (= 16)
inaktiv
4,28
4,30
* G. Schäfer, unveröffentlicht.
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G. Schäfer et al. • Oxidative und Photo-Phosphorylierung
189
(Tab. V). Auch die Potenz als Hemmstoff des photo- dem Befund an anderen Substanzklassen und Hemm-
synthetischen Elektronentransportes wird durch N- stoffen des Elektronentransportes in Chloropiasten
im Bereich von Photosystem I I 18_20.
Methylierung erniedrigt. Dies steht im Einklang mit
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