Formate Oxidase (FOx) from Aspergillus oryzae: One Catalyst Enables Diverse H2O2-Dependent Biocatalytic Oxidation Reactions

Article abstract of DOI:10.1002/anie.201902380

An increasing number of biocatalytic oxidation reactions rely on H₂O₂ as a clean oxidant. The poor robustness of most enzymes towards H₂O₂, however, necessitates more efficient systems for in situ H₂O₂ generation. In analogy to the well-known formate dehydrogenase to promote NADH-dependent reactions, we here propose employing formate oxidase (FOx) to promote H₂O₂-dependent enzymatic oxidation reactions. Even under non-optimised conditions, high turnover numbers for coupled FOx/peroxygenase catalysis were achieved.

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A Journal of the Gesellschaft Deutscher Chemiker
Angewandte
International Edition Chemie
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Accepted Article
Title: Formate oxidase (FOx) from Aspergillus oryzae: one catalyst to
promote H2O2-dependent biocatalytic oxidation reactions
Authors: Frank Hollmann, Florian Tieves, Sébastien Jean-Paul Willot,
Morten Martinus Cornelis Harald van Schie, Marine Charlène
Renée Rauch, Sabry Hamdy Hamed Younes, Wuyuan
Zhang, Patricia Gomez de Santos, John Mick Robbins,
Bettina Bommarius, Miguel Alcalde, and Andreas Bommarius
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Angew. Chem. 10.1002/ange.201902380
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Formate Oxidase (FOx) from Aspergillus oryzae: One Catalyst
Promotes H -Dependent Biocatalytic Oxidation Reactions
2
O
2
Florian Tieves,[a]+ Sébastien Jean-Paul Willot,[a]+ Morten Martinus Cornelis Harald van Schie, Marine
[a]
[a]
[a,b]
[a]
[a]
Charlène Renée Rauch, Sabry Hamdy Hamed Younes, Wuyuan Zhang, JiaJia Dong, Patricia
[c]
[d]
[d]
[c]
Gomez de Santos, John Mick Robbins, Bettina Bommarius, Miguel Alcalde, Andreas Sebastian
[d]
[a]
Bommarius, Frank Hollmann *
Abstract: An increasing number of biocatalytic oxidation reactions
A viable solution of the challenge outlined above is to make
2 2
use of H O ,
-dependent ‘Peroxizymes’.[5] By using
Peroxizymes actually make use of the Oxygen Dilemma instead
rely on H O
2 2
as clean oxidant. The poor robustness of most enzymes
, however, necessitates more efficient in situ H
H
2
O
2
towards H O
2 2
O
2 2
generation systems. In analogy to the well-known formate
dehydrogenase to promote NADH-dependent reactions, we here
of being hampered by it (Scheme 1b).
2 2
A range of enzymes are able to use H O . Peroxidases for
propose employing formate oxidase (FOx) to promote
2 2
H O -
example, represent model enzymes for
H
2
O
2
-dependent
dependent enzymatic oxidation reactions. Already under non-
optimised conditions, high turnover numbers for coupled
peroxygenase-FOx catalysis have been achieved.
oxidation,[ polymerisation[7] or halogenation reactions. More
recently, peroxygenases receive a lot of attention for selective
oxyfunctionalisation reactions.[ In addition to these reactions
6]
[8]
9]
hydrolase-catalysed formation of peracids for
2 2
H O -driven
epoxidation-[10] and Baeyer-Villiger oxidations[11] are becoming
popular.
Enzymatic oxidation and oxyfunctionalisation reactions are
currently receiving tremendous interest in preparative organic
chemistry.[1] Especially if selectivity is desired, enzymes often
excel over the chemical counterparts. Amongst available
biocatalysts, mostly monooxygenases are considered.[
Monooxygenases, however, rely on molecular oxygen, which is
reductively activated at the enzymes’ active sites. The reducing
equivalents required are mostly derived more or less directly from
reduced nicotinamide cofactors (NAD(P)H). While issues of in situ
regeneration of NAD(P)H to use it in catalytic amounts are largely
solved,[3] the Oxygen Dilemma poses a more severe challenge:[4]
many monooxygenases cannot utilise NAD(P)H directly but
depend on single electron mediators to transform the hydride
transfer from NAD(P)H into two successive single electron
transport events. The reduced mediators, however, also directly
interact with dissolved molecular oxygen and are re-oxidised
2]
(
Scheme 1a). As a consequence, reactive oxygen species are
Scheme 1. Biocatalytic oxyfunctionalisations using monooxygenases (a) or
peroxizymes (b). Monooxygenases often are prone to the Oxygen Dilemma
while peroxizymes productively use the Oxygen Dilemma.
formed in a futile cycle uncoupling the regeneration reaction from
the oxygenation reaction. Thus, in extreme cases up to 95% of
the reducing equivalents provided by the cosubstrate are
wasted.[4]
Enzymes, however, are also prone to oxidative inactivation by
H
2
O [
2
12]
2 2
which is why a broad range of in situ H O generation
[a]
Dr. F. Tieves[+], S.J. Willot[+], M.C.R. Rauch, M.M.C.H. van Schie,
Dr. S.H.H. Younes, Dr. W. Zhang, Dr. J.J. Dong, Dr. F. Hollmann*
Department of Biotechnology
methods have been investigated in the past years (Table S2
compares some established systems with respect to efficiency
and waste generation). The goal is to provide the production
University of Technology Delft
van der Massweg 9, 2629HZ Delft (The Netherlands)
E-mail: f.hollmann@tudelft.nl
Chemistry Department, Faculty of Science, Sohag University, Sohag
enzymes with H
minimising the undesired oxidative inactivation by excess H
Today, glucose oxidase (GOx) is the catalyst of choice for in situ
generation.[ It couples the oxidation of glucose to the
2 2
H O
reductive activation of O
robust fashion. The GOx system, however, suffers from large
2 2
waste generation (196 g of gluconate waste per mol H O
equivalent are generated).[ Also practical issues such as high
viscosity of the reaction medium have to be dealt with at larger
scales. Formate would be a more suitable reductant for the
O
at rates that allow high catalytic turnover while
2
2
.[13]
2
O
2
[
b]
c]
82524, Egypt
14]
[
P. Gomez de Santos, Prof. Dr. M. Alcalde
Department of Biocatalysis
Institute of Catalysis, CSIC
2 2 2
to form H O in a highly efficient and
28049 Madrid (Spain)
[
d]
+]
Dr. J.M. Robbins, Dr. B. Bommarius, Prof. Dr. A. S. Bommarius
School of Chemical and Biomolecular Engineering
Georgia Institute of Technology
15]
311 Ferst Drive, N.W., Atlanta, GA 30332 (USA)
[
These authors contributed equally to this work
reductive activation of O
therefore not accumulating CO
The systems available today, however, either rely on
2
(generating only 44 g of volatile and
2
waste per mol H equivalent).
2 2
O
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the document.
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bioincompatible transition metal catalysts, are too complex[15,
[16]
1
7]
or too elaborate[18] to be practical.
Recently, a formic acid oxidase from Aspergillus oryzae
(
AoFOx) has been reported as the first member of the Glucose-
Methanol-Choline (GMC) oxidoreductase superfamily oxidizing
formic acid instead of simple alcohols.[19] This enzyme features an
optimum pH range from 2.8-6.8 and a kcat value of 82 s- over that
range. It contains an unusual 8-formyl FAD cofactor, which is
formed in situ from FAD through self-oxidation. Its unique catalytic
1
properties render AoFOx a promising candidate for H
2 2
O
dependent enzymatic reactions. We therefore set out to evaluate
the potential of AoFOx as catalyst to promote H O -dependent
2 2
biocatalytic oxidation reactions (Scheme 2).
Scheme 2. The formate oxidase from Aspergillus oryzae (AoFOx) enables the
in situ H generation from formate and ambient oxygen to promote a broad
2 2
O
range of biocatalytic oxidation/oxyfunctionalisation reactions.
AoFOx was prepared according to a previously published
procedure.[19] In short, AoFOx was expressed in recombinant
Escherichia coli and partially purified to remove catalase. Overall,
from 1 L culture broth 38 mg of purified enzyme were obtained
within 1 day (Figure S1).
Figure 1. Characterisation of the reaction parameters influencing the
efficiency of the bienzymatic hydroxylation of ethyl benzene. The individual
reaction conditions are given in the captions of Figures S2 to 8).
Having AoFOx in hand, we decided to first apply this enzyme
for some selective oxyfunctionalisation reactions catalysed by the
recombinant, evolved unspecific peroxygenase from Agrocybe
aegerita (rAaeUPO) heterologously expressed in Pichia
pastoris.[ As model reaction we first focused on the selective
hydroxylation of ethyl benzene into (R)-1-phenylethanol. A
preliminary optimisation of the reaction conditions (Figure 1)
revealed that the bienzymatic cascade operates optimally in
slightly acidic reaction media (pH6, Figure 1a, Figure S2) which is
20]
2 2 2 2
The relative ratio of (H O -generating) AoFOx and (H O -
consuming) rAaeUPO had a very pronounced effect on the
efficiency of the overall reaction system (Figure 1c, Figure S5).
The highest initial rate was observed at an equimolar ratio of
both enzymes albeit at the expense of a poor long-term stability
of the overall system (after 5 h no further product formation was
observed, Figure S5). Lower ratios of AoFOx to rAaeUPO gave
lower productivities but were significantly more robust. Already
at a ratio of 1:5, stable product formation for at least 24 h was
observed.
in line with the reported preferences of the catalysts.[
21]
An
o
apparent optimal temperature of 25 C was determined (Figure 1b,
o
Figure S3). Between 20 and 35 C the initial rates of the overall
system were largely temperature-independent (Figure S2) but the
o
reaction ceased sooner at elevated temperatures. At 40 C for
example, no further product formation was observed after 2h. In
contrast, steady product accumulation occurred at 30 C or lower.
This behaviour can be attributed to the comparably poor thermal
robustness of wt-AoFOx.
The availability of molecular oxygen had a significant
influence on the overall reaction (Figure 1e). Under ambient
o
atmosphere without stirring an O
2
transfer rate of 0.84 ± 0.03
mM h-1 was estimated (Figure S7) limiting the productivity of
the overall system. Increasing the O availability by increasing
the O concentration in the headspace of the reaction
dramatically increased the productivity of the overall reaction
more than ten-fold (Figure 1e, Figure S8).
2
We determined an apparent optimal formate concentration of
2
00 mM (Figure 1d, Figure S4) which represents a compromise
2
value of wt-AoFOx at this pH[
19d-f]
between the relatively high K
M
and the decreasing peroxygenative activity of UPOs at higher
formate concentrations.[22]
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It is worth mentioning here, that for all experiments
reported here appropriate negative controls (i.e. reactions
leaving out either one of the enzyme catalysts or reactions in
the absence of formate) gave no product formation; the sole
exception being CytC-catalysed sulfoxidation (where also
traces of sulfoxide were observed in the absence of CytC).
generation systems.[16] The lack of enantioselectivity in the
sulfoxidation of thioanisol is in accordance with previous
reports.[ It should be kept in mind here that CytC’s natural role
is not that of an enzyme but rather that of an electron transport
protein.
16]
Another important H
2 2
O -driven reaction is the so-called
[
1b, 24]
Next we explored the enzyme and product scope of the
perhydrolase reaction of lipases.
In short, a lipase catalyses
AoFOx-catalysed H
2
O
2
generation system to promote various
the perhydrolysis of carboxylic (esters) yielding a reactive peracid,
which in turn can undergo Baeyer-Villiger oxidations of ketones or
Prilezhaev oxidations of C=C-double bonds. Principally, our
2 2
H O
-dependent biocatalytic oxidation reactions (Figure 2).
First, we investigated some peroxygenase-catalysed
2
hydroxylation- and epoxidation reactions. The proposed H O -
proposed AoFOx-H
2
O
2
generation system proved to be
2
applicable to drive these reactions (Figure 2). Using the lipase B
from Candida antarctica, CalB) together with octanoic acid as
cocatalyst gave catalytic turnover in the chemoenzymatic Baeyer-
Villiger oxidation of cyclohexanone as well as the
chemoenzymatic epoxidation of styrene. Compared to the other
systems investigated here, rather low turnover numbers for the
generation system enabled excellent catalytic performance of the
peroxygenase used. Both, product concentrations and rAaeUPO-
turnover numbers were at least as high as in previous reports
2 2
using more complicated H O
generation systems![15, 18, 20d, 23]
The stereospecific hydroxylation of ethyl benzene was
performed on semi-preparative scale yielding 434 mg of (R)-1-
phenylethanol (>99 % ee, see SI for further details). A very
satisfactory turnover number for the AoFOx of more than
biocatalyst were observed. This can be attributed to the low
2 2
affinity of CalB towards H O
in aqueous systems [ resulting in
25]
low CalB activity under the conditions chosen. Further
1.000.000 was achieved pointing towards an economically
2 2
investigations aiming at higher in situ H O -concentrations are
feasible in situ H generation system. Also it is worth
2
O
2
currently ongoing in our lab.
mentioning that up to 31 ± 3 mM (R)-1-phenylethanol was
produced (Figure S6) which is one of the highest numbers
observed so far using rAaeUPO.[15] It should be mentioned here
that in case of volatile reagents imperfect mass balances were
observed upon prolonged reaction times. We believe that this is a
technical issue that will be overcome in future upscaling
experiments.
Finally, we evaluated AoFOx to promote halogenation
reactions catalysed by the V-dependent haloperoxidase from
Curvularia inaequalis.[8b, 8c, 26] The hydroxyhalogenation of styrene
gave acceptable results in terms of product yield and catalyst
performance. Again, the volatility of the reagents impaired the
final product concentration and therewith the catalytic numbers. A
completely different picture evolved, however, when using 4-
pentenoic acid as starting material. Here, a perfect mass balance
was observed and full conversion of the starting material into the
desired bromolactone was observed. We also scaled up this
reaction to gram-scale: Starting from 200 mM 4-pentenoic acid
150 mM of the desired bromolactone was obtained which could
be separated from the reaction mixture by simple extraction
Cytochrome C (CytC), another heme-containing protein
2 2
capable of H O -driven oxygen transfer reactions, especially
sulfoxidation[ was evaluated next. Compared to the turnover
numbers observed with rAaeUPO, the numbers achieved with
CytC appear rather low. However, these numbers are still
16]
2 2
significantly higher than achieved previously using other H O
(
Figure S14). Thus, 1.6 g of the pure product were obtained.[27
.
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Further developments in our laboratories will focus on further
engineering AoFOx (especially a lower K value towards formate
M
is highly desirable) and further characterisation and optimisation
of the synthetic schemes to fully explore its synthetic potential.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge funding by the European
Research Commission (ERC consolidator grant, No. 648026),
the European Union (H2020-BBI-PPP-2015-2-1–720297), the
Netherlands Organisation for Scientific Research (VICI grant No.
724.014.003), and the National Science Foundation of the
United States (grant IIP-1540017).
Keywords: Biocatalysis • Oxidation • Oxyfunctionalisation •
Hydrogen peroxide • Formate oxidase
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(
CiVCPO) initiated hydroxyhalogenation and halolactonisation
reactions; finally, using lipase B from Candida antarctica (CalB)
chemoenzymatic epoxidation and Baeyer-Villiger oxidations were
performed. For details about the reaction schemes and
experimental results, please refer to the respective section in the
SI. Yields shown are calculated from the product concentration
divided by the initial starting material concentration.
[4]
[5]
2 2
As Peroxizymes, we define all enzymes that (in principle) can use H O
as stoichiometric oxidant. Examples are the classical peroxidases and
peroxygenases but also other heme-containing biocatalysts such as
P450 monooxygenases and also hydrolases..
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J. Li, Z. Guo, R. Renirie, R. Wever, F. Hollmann, Chem. Commun. 2017,
In conclusion, with this contribution we have provided the
proof-of-concept for a simple H
formate oxidases such as the FOx from Aspergillus oryzae
AoFOx). This system excels through its practical simplicity and
its excellent performance already at this early stage of
development. The turnover numbers achieved with AoFOx
exceed those of established systems by orders of magnitude
2 2
O generation system based on
5
3, 6207-6210; c) E. Fernández-Fueyo, M. van Wingerden, R. Renirie,
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Three decades ago, the introduction of formate
dehydrogenases as NADH regeneration catalysts ushered in a
new era in bioreduction catalysis.[
formate oxidases will have
28]
We are convinced that
similar impact for
a
[11] a) M. Markiton, S. Boncel, D. Janas, A. Chrobok, ACS Sus. Chem. Eng.
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23] a) S. Peter, M. Kinne, R. Ullrich, G. Kayser, M. Hofrichter, Enz. Microb.
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5
Adv. 2017, 7, 12518-12523.
[
[
[
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b) R. Wever, R. Renirie, in Peroxidases and Catalases: Biochemistry,
Biophysics, Biotechnology, and Physiology,, 2010, pp. 363-385.
27] This corresponds to an isolated yield of 45%. However, performing a
second extraction, more product (albeit contaminated with the starting
material) was obtained.
28] a) Z. Shaked, G. M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 7104-
7105; b) V. O. Popov, V. S. Lamzin, Biochem. J. 1994, 301, 625-643; c)
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Florian Tieves, Sébastien Jean-Paul
Willot, Marine Charlène Renée Rauch,
Morten Martinus Cornelis Harald van
Schie, Sabry Younes, Wuyuan Zhang,
JiaJia Dong, Patricia Gomez de Santos,
John Mick Robbins, Bettina Bommarius,
Miguel Alcalde, Andreas Sebastian
Bommarius, Frank Hollmann
Page No. – Page No.
Formate oxidase (FOx) from
Aspergillus oryzae: one catalyst to
The formate oxidase from Aspergillus oryzae (AoFOx) enables the in situ H
generation from formate and ambient oxygen to promote a broad range of
biocatalytic oxidation/oxyfunctionalisation reactions.
2 2
O
2 2
promote H O -dependent biocatalytic
oxidation reactions
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Formiatoxidase (FOx) aus Aspergillus oryzae: ein Katalysator für
verschiedene H -abhängige biokatalytische Oxidationen
2
O
2
Florian Tieves,[a]+ Sébastien Jean-Paul Willot,[a]+ Morten Martinus Cornelis Harald van Schie, Marine
[a]
[a]
[a,b]
[a]
[a]
Charlène Renée Rauch, Sabry Hamdy Hamed Younes, Wuyuan Zhang, JiaJia Dong, Patricia
[c]
[d]
[d]
[c]
Gomez de Santos, John Mick Robbins, Bettina Bommarius, Miguel Alcalde, Andreas Sebastian
[d]
[a]
Bommarius, Frank Hollmann *
Abstract: Ein Vielzahl biokatalytischer Oxidationsreaktionen
unerwünschten Nebenreaktion wird die Regenerationsreaktion
von der eigentlichen Oxygenierungsreaktion entkoppelt. In
extremen Fällen gehen so bis zu 95% der von den Kosubstraten
bereitgestellten Reduktionsäquivalente nutzlos verloren.[4]
verwenden H
Stabilität von Enzymen die Verwendung eines effizienten in situ-
-Generationssystems. In Anlehnung an die, für NADH-
2 2
O als Oxidans. Oftmals erfordert allerdings die geringe
2 2
H O
abhängige Reaktionen weit verbreitete, Formiatdehydrogenase
schlagen wir hier die Verwendung einer Formiatoxidase (FOx) vor, um
2 2
H O -abhängige „Peroxizyme“ stellen eine vielversprechende
Lösung dar. Statt durch das Sauerstoffdilemma behindert zu
[
5]
2 2
H O -abhängige enzymatische Oxidationen anzutreiben. Bereits
werden, nutzen sie es produktiv (Schema 1b).
unter nicht-optimierten Bedingungen wurden sehr vielversprechende
Katalysatorwechselzahlen bei der Kopplung von FOx mit
Peroxygenasen erzielt.
Eine ganze Reihe an Enzymen sind in der Lage, H
2 2
O zu
verwenden. Peroxidasen zum Beispiel sind archetypisch und
2 2
katalysieren H O
-abhängige Oxidationen, Polymerisierungen[7]
[
6]
[
8]
oder Halogenierungsreaktionen. Seit neuerem treten auch
Peroxygenasen in den Vordergrund.[ Darüber hinaus eignen
sich Hydrolasen als Katalysatoren für die Synthese von
Persäuren und den damit zugänglichen Epoxidierungs-[10] und
Baeyer-Villiger-Oxidationen.[11]
9]
Enzyme erfreuen sich eines stetig wachsenden Interesses als
Oxidations- und Oxyfunktionalisierungskatalysatoren in der
[
1]
präparativen organischen Synthese. Insbesondere hinsichtlich
ihrer Selektivität zeichnen sich Enzyme gegenüber ihrer
chemischen Gegenstücken aus. Derzeit stehen die sogenannten
Monooxygenasen im Vordergrund.[2] Ein Nachteil dieser Enzyme
ist allerdings, dass sie auf molekularen Sauerstoff angewiesen
sind den sie in ihrer aktiven Tasche reduktiv aktivieren. Die dafür
benötigten Reduktionsäquivalente stammen, mehr oder weniger
direkt, aus reduzierten Nikotinamidkofaktoren (NAD(P)H). Deren
in situ Regeneration kann mittlerweile als etabliert betrachtet
werden,[3] jedoch stellt das sogenannte Sauerstoffdilemma eine
schwerwiegendere Herausforderung dar:[4] ein Großteil der
Monooxygenasen kann NAD(P)H nicht direkt verwenden,
sondern benötigt Einelektronenmediatoren als Relaissystem,
Dadurch wird die mechanistische Inkompatibilität zwischen
NAD(P)H als Hydriddonor und den Monooxygenasen als
Einelektronenakzeptoren
überbrückt.
Die
reduzierten
Einelektronenmediatoren werden allerdings auch direkt von
gelöstem Sauerstoff re-oxidiert (Schema 1a). Infolge dieser
Schema 1. Biokatalytische Oxyfunktionalisierungsreaktionen mittels
Monooxygenasen (a) oder Peroxizymen (b). Während Monooxygenasen häufig
durch das Sauerstoffdilemma behindert werden, nutzen Peroxizyme dieses.
[a]
Dr. F. Tieves[+], S.J. Willot[+], M.C.R. Rauch, M.M.C.H. van Schie,
Dr. S.H.H. Younes, Dr. W. Zhang, Dr. J.J. Dong, Dr. F. Hollmann*
Department of Biotechnology
Da Enzyme generell labil gegenüber oxidativer Inaktivierung
2 2
O
sind[12] wurden in der Vergangenheit eine Reihe in situ
durch H
-Generierungsmethoden entwickelt (in Tabelle S2 sind die
gängigsten Systeme aufgelistet und hinsichtlich ihrer Effizienz
und Abfallbildung verglichen). Ziel ist, H in solchen Raten zu
generieren dass die katalytische Effizienz der Peroxizyme
University of Technology Delft
van der Massweg 9, 2629HZ Delft (The Netherlands)
E-mail: f.hollmann@tudelft.nl
2 2
H O
[
b]
c]
Chemistry Department, Faculty of Science, Sohag University, Sohag
2
O
2
82524, Egypt
[
P. Gomez de Santos, Prof. Dr. M. Alcalde
Department of Biocatalysis
Institute of Catalysis, CSIC
2 2
maximiert während ihre oxidative Inaktivierung durch H O
minimiert wird.[
13]
Derzeit ist Glukoseoxidase (GOx) der
28049 Madrid (Spain)
[14]
Katalysator der Wahl. Sie koppelt hocheffizient und robust die
Oxidation von Glukose an die reduktive Aktivierung von
Sauerstoff. Allerdings produziert dieses System auch große
[
d]
+]
Dr. J.M. Robbins, Dr. B. Bommarius, Prof. Dr. A. S. Bommarius
School of Chemical and Biomolecular Engineering
Georgia Institute of Technology
311 Ferst Drive, N.W., Atlanta, GA 30332 (USA)
2 2
Mengen an Abfall (so werden pro mol H O auch 196 g
Glucuronsäureabfall gebildet).[15] Darüber hinaus bestehen
hinsichtlich der Maßstabsvergrößerung auch praktische
[
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Herausforderungen
wie
die
Viskosität
konzentrierter
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Glukoselösungen. Ameisensäure wäre hier besser geeignet da
AoFOx bei diesem pH[19d-f] und der abnehmenden
bei seiner Oxidation lediglich 44 g (pro mol H
Nebenproduktes CO anfallen. Leider sind die bisher etablierten
Methoden entweder nicht biokompatibel aufgrund der
2
O
2
) des flüchtigen
Peroxygenaseaktivität
Formiatkonzentrationen darstellt.
von
UPOs
bei
höheren
[
22]
2
[
16]
[15,
Verwendung von Übergangmetallkatalysatoren, zu komplex
1
7]
oder zu aufwendig[18] um von praktischem Nutzen zu sein.
Kürzlich berichteten einige von uns eine neuartige
Formiatoxidase aus Aspergillus oryzae (AoFOx) als erstes
Beispiel eines Enzyms aus der Glukose-Methanol-Cholin (GMC)
Oxidoreduktasesuperfamilie das Ameisensäure statt kurzkettiger
Alkohole oxidiert.[ Das Enzym weist ein breites pH-Spektrum
19]
(
2.8 – 6.8) mit kcat-Werten von über 82 s-1 in diesem Bereich auf.
Sein ungewöhnlicher 9-Formyl-FAD-Kofaktor wird autokatalytisch
gebildet. Diese Eigenschaften machen aus unserer Sicht AoFOx
zum idealen Kandidaten H
anzutreiben (Schema 2).
2 2
O -abhängige Peroxizymreaktionen
Schema 2. Formiatoxidase aus Aspergillus oryzae (AoFOx) als
Bildungskatalysator um biokatalytische, -abhängige Oxidations- und
Oxyfunktionalisierungsreaktionen anzutreiben.
2 2
H O -
2 2
H O
Analog zum publizierten Protokoll[19] wurde AoFOx mittels
rekombinanter Expression in Escherichia coli produziert und, zur
Entfernung von Katalaseverunreinigungen, teilweise aufgereinigt.
Innerhalb eines Tages konnten so 38 mg des gereinigten
Enzymes aus einer 1L Kulturlösung erhalten werden. (Abbildung
S1).
Abbildung 1. Bestimmung des Einflusses einiger Reaktionsparameter auf
die Effizienz der bienzymatischen Hydroxylierung von Ethylbenzol. Die
individuellen Reaktionsbedingungen finden sich in den Abbildungen S2 bis
S8.
Als erstes Testenzym wählten wir die sogenannte
unspezifische Peroxygenase aus Agrocybe aegerita (rAaeUPO)
die wir mittels heterologer Expression in Pichia pastoris
erhielten.[20] Als Modelreaktion diente uns die selektive
Hydroxylierung von Ethylbenzol zu (R)-1-Phenylethanol. Die
bienzymatische Kaskade wurde zunächst hinsichtlich der
optimalen Reaktionsbedingungen untersucht. Schwach azide
Reaktionsbedingungen waren optimal (pH 6, Abbildung 1a,
Abbildung S2), wie auch aus den optimalen pH-Werten der
Einzelenzyme zu erwarten war.[ Weiterhin erwies sich eine
Das Konzentrationsverhältnis zwischen (H
AoFOx und (H -verbrauchender) rAaeUPO hatte einen
ausgeprägten Einfluss auf die Effizienz des Gesamtsystems
Abbildung 1c, Abbildung S5). Die höchste Anfangsrate wurde
2 2
O -bildender)
2
O
2
(
bei äquimolaren Konzentrationen beider Enzyme beobachtet;
allerdings auf Kosten der Stabilität (bereits nach 5 Stunden war
keine Produktbildung mehr beobachtbar, Abbildung S5).
Niedrigere AoFOx-Konzentrationen wirkten sich nachteilig auf
die Reaktionsrate aber vorteilhaft auf die Robustheit des
Gesamtsystems aus. Bei einem Verhältnis von 1:5 konnte eine
stabile Produktakkumulation über wenigstens 24 Stunden
beobachtet werden.
21]
o
Temperatur von 25 C als geeignet (Abbildung 1b, Abbildung S3).
Zwar
stieg
die
Aktivität
des
Gesamtsystems
bei
o
Temperaturerhöhung bis 35 C an, allerdings auf Kosten der
Stabilität (Abbildung S2). So stoppte die Reaktion bei 40 C bereits
nach 2 Stunden während sie bei 30 C oder niedriger deutlich
o
o
länger anhielt. Dies kann auf die relativ niedrige Thermotoleranz
der
Formiatkonzentration von 200 mM erwies sich als optimal, was
einen Kompromiss zwischen dem relativ hohen K -Wert der wt-
Wildtyp-AoFOx
zurückgeführt
werden.
Eine
Schließlich beeinflusste auch die Verfügbarkeit an
molekuarem Sauerstoff die Gesamtreaktion (Abbildung 1e).
M
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Die O
2
-Transferrate in das Reaktionsmedium betrug unter
Sauerstofftransferreaktionen, insbesondere Sulfoxidationen,
berichtet wurde.[16] Verglichen mit den Wechselzahlen mit
rAaeUPO erscheinen die Werte mit CytC sehr niedrig, liegen
Umgebungsatmosphäre und ohne Rühren 0.84 ± 0.03 mM h-
1
(
Abbildung S7) und begrenzte somit die Gesamtrate des
Systems. Diese konnte durch Erhöhung des O -Partialdrucks
in der Gasphase dramatisch um mehr als das Zehnfache
erhöht werden (Abbildung 1e, Abbildung S8).
2
2 2
allerdings deutlich über den bisher mit anderen H O -
Bildungssystemen erreichten Wechselzahlen.[16] Die fehlende
Enantioselektivität im Falle der Sulfoxidation von Thioanisol ist im
Einklang mit früheren Berichten[
16]
und ist wohl auf CytC
Hier sei erwähnt, dass für alle hier berichteten Reaktionen
die entsprechenden Negativkontrollen durchgeführt wurden
natürliche Rolle als Elektronentransportprotein anstatt eines
Enzymes zurückzuführen.
(
insbesondere Reaktionen in Abwesenheit der Katalysatoren
oder von Formiat). Mit Ausnahme der weiter unten
besprochenen Reaktionen mit CytC (wo auch ohne CytC
Spuren an Sulfoxid nachweisbar waren) war in keiner dieser
Kontrollreaktionen Produktbildung beobachtbar.
Eine weitere, wichtige H
2 2
O -getriebene Reaktion ist die
sogenannte Perhydrolasereaktion vieler Lipasen.[
1b,
24]
Zusammengefasst handelt es sich hier um die Lipase-katalysierte
Perhydrolyse von Carbonsäure(estern) zu den entsprechenden
Persäuren. Letztere können für Prileschajew- oder Baeyer-
Villiger-Reaktionen verwendet werden. Wie in Abbildung 2
Als nächstes interessierten wir uns für eine breitere
Anwendbarkeit des vorgeschlagenen AoFOx-basierten H
2 2
O -
gezeigt, ist das vorgeschlagene AoFOx-basierte
2 2
H O -
Generierungssystems auf weitere Peroxygenasereaktionen
Abbildung 2).
Bildungssystem prinzipiell geeignet auch diese Reaktionen
anzutreiben. Unter Verwendung der Lipase B aus Candida
antarctica (CalB) und Oktansäure als Co-Katalysatoren gelangen
sowohl die chemoenzymatische Baeyer-Villiger Oxidation von
Cyclohexan als auch die Epoxidierung von Styrol. Auch hier
waren die Wechselzahlen vergleichsweise niedrig, was sich aber
(
Zunächst untersuchten wir weitere Peroxygenase-
katalysierte Hydroxylierungs- und Epoxidierungsreaktionen. In
allen Beispielen ermöglichte das vorgeschlagene System
exzellente Katalysatorwechselzahlen die wenigstens im Bereich
der Werte von zuvor berichteten, allerdings komplexerer,
2 2
auf die geringe Affinität von CalB zu H O in wässrigen
Systeme lagen.[
15, 18, 20d, 23]
Die Hydroxylierung von Ethylbenzol
Systemen[25] und die daraus resultierende geringe Reaktionsrate
unter den vorliegenden Bedingungen zurückzuführen ist. Weitere
Optimierungsarbeiten laufen gerade.
gelang im semi-präparativen Maßstab und erbrachte 434 mg des
enantiomerenreinen Produktes ((R)-1-Phenylethanol, >99 % ee,
siehe SI für weitere Details). Dabei erreichte die AoFOx
Wechselzahlen im Bereich von über einer Million, was auf eine
ökonomische Anwendbarkeit diese Enzyms hindeutet. Auch die
erzielte Produktkonzentration von 31 ± 3 mM (R)-1-Phenylethanol
Schließlich haben wir uns den Halogenierungsreaktionen
durch die V-abhängige Haloperoxidase aus Curvularia
inaequalis[8b, 8c, 26] zugewandt. Die Hydroxyhalogenierung von
Styrol gab annehmbare Ergebnisse hinsichtlich Produktausbeute
und Katalysatornutzung. Wiederum stellte die Flüchtigkeit der
Reagenzien die Hauptlimitation dar. Im Gegensatz dazu verlief
die Bromolaktonisierung von 4-Pentensäure sehr gut bei
geschlossener Massenbilanz. Aus diesem Grund wurde die
Reaktion auch im präparativen Maßstab durchgeführt. Aus 200
mM 4-Pentansäuere wurden 150 mM des gewünschten
Bromolaktons erhalten und extraktiv isoliert (Abbildung S14).
Insgesamt wurden so 1.6 g des reinen Produktes erhalten.[27]
(
Abbildung S6) liegt im oberen Bereich der bisher mit rAaeUPO
berichteten Produktkonzentrationen.[
15]
Im Falle flüchtiger
Reagenzien waren die Massenbilanzen bei längeren
Reaktionszeiten nur unbefriedigend. Allerdings halten wir dieses
technische Problem für lösbar wenn die Reaktionen weiter
maßstabsvergrößert werden.
Als nächstes untersuchten wir Cytochrom C (CytC), ein
weiteres
Hämenzym
welches
für
2 2
H O -getriebene
.
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weiteren Umsetzung und Charakterisierung des Konzeptes um
sein Potential voll auszuschöpfen.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Europäischen Forschungskommission
(
(
ERC consolidator grant, No. 648026), der Europäischen Union
H2020-BBI-PPP-2015-2-1–720297), der niederländischen
Organisation zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung
VICI grant No. 724.014.003) sowie der nationalen
Wissenschaftsstiftung der Vereinigten Staaten von Amerika
grant IIP-1540017) für finanzielle Unterstützung.
(
(
Keywords: Biokatalysis • Oxidation • Oxyfunktionalisierung •
Wasserstoffperoxid • Formiateoxidase
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F. H. Arnold, Curr. Opin. Biotechnol. 2011, 22, 809–817.
Abbildung 2. Spektrum der AoFOx-angetriebenen Peroxizymreaktionen.
Selektive Hydroxylierungs- und Epoxidierungsreaktionen mit der Peroxygenase
aus Agrocybe aegerita (rAaeUPO); Cytochrom
Sulfoxidation von Thioanisol; Hydroxyhalogenierungen
Bromolaktonisierungen mit der V-abhängigen Haloperoxidase aus Curcuvaria
inaequalis (CiVCPO) und chemoenzymatische Epoxidierungs- und Baeyer-
C
(CytC)-vermittelte
und
[3]
a) S. Kara, J. H. Schrittwieser, F. Hollmann, M. B. Ansorge-Schumacher,
Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98, 1517–1529; b) A. Weckbecker, H.
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D. Holtmann, F. Hollmann, ChemBioChem 2016, 17, 1391-1398.
Villiger-Oxidationen mit der Lipase
B aus Candida antarctica (CalB).
[4]
5]
Einzelheiten zu den Reaktionen finden sich in der SI. Ausbeuten wurden
basierend auf der eingesetzten Substratmenge und erhaltenen Produktmenge
berechnet.
[
2 2
Als Peroxizyme bezeichnen wir alle Enzyme die (grundsätzlich) H O für
Oxidationsreaktionen verwenden können. Klassische Beispiele sind
Peroxidasen und Peroxygenasen aber auch weitere Hämenzyme wie
P450 Monooxygenasen und auch Hydrolasen.
[
6]
F. van Rantwijk, R. A. Sheldon, Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11, 554-
Zusammengefasst haben wir hier die Grundlage für ein
allgemein anwendbares H O -Generationssystem basierend auf
2 2
564.
[
7]
8]
F. Hollmann, I. W. C. E. Arends, Polymers 2012, 4, 759-793.
der Ameisensäureoxidase aus Aspergillus oryzae (AoFOx) gelegt.
Dieser Ansatz zeichnet sich insbesondere durch seine
Einfachheit aus. Darüber hinaus überzeugen die exzellenten
Katalysatorwechelzhalen sowohl für AoFOx als auch für
Peroxidasen und Peroxygenasen. Diese übertreffen bisher
erreichte Wechselzahlen teilweise um Größenordnungen
[
a) C. J. Seel, A. Králík, M. Hacker, A. Frank, B. König, T. Gulder,
ChemCatChem 2018, 10, 3960-3963; b) J. J. Dong, E. Fernandez-Fueyo,
J. Li, Z. Guo, R. Renirie, R. Wever, F. Hollmann, Chem. Commun. 2017,
53, 6207-6210; c) E. Fernández-Fueyo, M. van Wingerden, R. Renirie,
R. Wever, Y. Ni, D. Holtmann, F. Hollmann, ChemCatChem 2015, 7,
4035-4038; d) D. Wischang, J. Hartung, Tetrahedron 2012, 68, 9456-
9463.
(
Tabelle S2).
[9]
a) M. Hofrichter, R. Ullrich, Curr. Opin. Chem. Biol. 2014, 19, 116-125;
b) Y. Wang, D. Lan, R. Durrani, F. Hollmann, Curr. Opin. Chem. Biol.
Vor dreißig
Jahren
hat
die
Einführung
der
2017, 37, 1-9.
Formiatdehydrogenase zur in situ Regeneration von NADH ein
neues Zeitalter in der biokatalytischen Reduktionschemie
eingeleitet. [28] Wir sind überzeugt, dass Formiatoxidasen eine
ähnliche Bedeutung für die biokatalytische Oxidations- und
Oxyfunktionalisierungschemie erlangen können.
[
10] a) J. Meyer-Wassewitz, D. Hohmann, M. B. Ansorge-Schumacher, M.
Kraume, A. Drews, Biochem. Eng. J. 2017, 126, 68-77; b) P. Zhou, X.
Wang, C. Zeng, W. Wang, B. Yang, F. Hollmann, Y. Wang,
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2
Weitere Entwicklungsschritte beinhalten die Evolution von
AoFOx-Varianten mit höherer Affinität zu Formiat und der
Brunissen, F. Allais, Front. Chem. 2016, 4, 11; c) A. Drozdz, A. Chrobok,
Chem. Commun. 2016, 52, 1230-1233.
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65.
5
[13] F. Sabuzi, E. Churakova, P. Galloni, R. Wever, F. Hollmann, B. Floris, V.
Conte, Eur. J. Inorg. Chem. 2015, 21, 3519-3525.
[
14] R. A. Sheldon, P. C. Pereira, Chem. Soc. Rev. 2017, 46, 2678-2691.
15] Y. Ni, E. Fernández-Fueyo, A. G. Baraibar, R. Ullrich, M. Hofrichter, H.
Yanase, M. Alcalde, W. J. H. van Berkel, F. Hollmann, Angew. Chem.,
[
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[
[
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27] Entspricht einer isolierten Ausbeute von 45%. Mehr Produkt (allerdings
mit Ausgangsmaterial verunreinigt) konnte mit weiteren Extraktionen
erhalten werden.
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Angewandte Chemie International Edition
10.1002/anie.201902380
COMMUNICATION
COMMUNICATION
Florian Tieves, Sébastien Jean-Paul
Willot, Marine Charlène Renée Rauch,
Morten Martinus Cornelis Harald van
Schie, Sabry Younes, Wuyuan Zhang,
JiaJia Dong, Patricia Gomez de Santos,
John Mick Robbins, Bettina Bommarius,
Miguel Alcalde, Andreas Sebastian
Bommarius, Frank Hollmann
Page No. – Page No.
Formate oxidase (FOx) from
Aspergillus oryzae: one catalyst to
The formate oxidase from Aspergillus oryzae (AoFOx) enables the in situ H
generation from formate and ambient oxygen to promote a broad range of
biocatalytic oxidation/oxyfunctionalisation reactions.
2 2
O
2 2
promote H O -dependent biocatalytic
oxidation reactions
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