Indoles for comparison with Amanita toxins. VI. Hydroxylation of tryptophan and tryptophyl peptides

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Indole zum Vergleich mit Amanita-Gihzn, V I1
Hydroxylierung von Tryptophan und Tryptophylpeptiden
P eter P faend er, G erfried f eiGe und t heodor W ieland
Institut für Organische Chemie der Universität Frankfurt am Main
(Z. Naturforsdbg. 23 b, 926— 930 [1968]; eingegangen am 26. August 1967)
Im System Fe2®, Äthylendiamintetraacetat, Ascorbat und Luftsauerstoff gelingt die Hydroxylie-
rung von Tryptophan, Tryptophyl-glycin, Tryptophyl-glycyl-isoleucyl-glycin und Phalloidin, wobei
verschiedene Stellen des Indolrings verschieden stark betroffen werden. Produkte einer 2-, 5-, 6- und
2.6-Hydroxylierung konnten spektroskopisch und papierchromatographisch nachgewiesen werden.
Bei den Peptiden gewann die Hydroxylierung des Benzolteils des Tryptophans die Überhand. Vom
Phalloidin wurde nur die Bildung eines phenolartigen Produkts, vergleichbar mit Amanitin, fest-
gestellt, wobei über die Stellung der neu eingeführten Hydroxylgruppe keine Aussage gemacht
werden kann.
a-Amanitin, das langsam wirkende Hauptgift von
Amanita phalloides, unterscheidet sich vom rasch
wirkenden Phalloidin unter anderem dadurch, daß
es in 6-Stellung des Tryptophanbausteins eine Hy-
droxylgruppe trägt, die dem Phalloidin fehlt2. Es
wurden daher Experimente geplant, den Chromo-
phor des Phalloidins durch Einführung einer Hy-
droxylgruppe in den des Amanitins zu verwandeln.
Zuvor jedoch stellten wir Modellversuche am Trypto-
phan (2 a) und einigen seiner Peptide an, die im
folgenden geschildert sind. Als hydroxylierendes
Agens wurde das System Fe20, Ascorbat, Äthylen-
diamintetraacetat, Luftsauerstoff im Phosphatpuffer
vom pH 6,8 bei 37° angewandt, das von U d en -
fr ie n d und Mitarbb. zur Hydroxylierung von Ben-
zolabkömmlingen 3 und von D a lg lie s h 4 sowie von
Ic h ih a ra und Mitarbb.5 bei Indolderivaten (Bil-
dung von 5- und 7-Hydroxy-indolen) benutzt wor-
den war.
H y d r o x y l i e r u n g v o n T r y p t o p h a n (2a)
Nach dreistündigem Durchsaugen von Luft durch
eine etwa 1,5-proz. Tryptophanlösung im Hydroxy-
lierungs-System zeigte ein Tropfen auf Filtrier-
papier beim Besprühen mit der Natriumcarbonat-
haltigen Lösung von diazotierter Sulfanilsäure
( P a u l y s Reagenz) deutlich rote Farbreaktion auf
Phenole, während Tryptophan selbst eine weniger
empfindliche Gelbfärbung verursachte. Die Intensi-
tät erhöhte sich nicht, wenn die doppelte Menge
an Eisenionen und Ascorbinsäure vorgelegt oder
wenn die Oxydation auf vier Stdn. ausgedehnt
wurde. Nach zwei Stdn. war sie geringer, so daß in
allen Versuchen eine Dauer von drei Stdn. eingehal-
ten wurde.
Nach Klarfiltrieren und Konzentrieren der gelb-
braunen Lösung bewies ein Papierchromatogramm
neben viel unverändertem Tryptophan das Vorlie-
gen mehrerer P a u 1y -positiver, mit Ninhydrin an-
färbbarer Verbindungen, die durch Säulenchromato-
graphie entsalzt, partiell getrennt und im einzelnen
charakterisiert wurden. In Abb. 1 ist das Elutions-
diagramm eines Oxydationsansatzes wiedergegeben,
wie es bei der Chromatographie an Sephadex G-10
vom Uvicord aufgeschrieben wurde.
Zur Analyse der Oxydationsansätze bedienten
wir uns der Papierchromatographie, die direkt und
nach säulenchromatographischer Trennung der Pro-
duktgemische an Sephadex G-10 in Wasser ausge-
führt wurde, sowie der UV-spektroskopischen Unter-
suchung der mehr oder weniger deutlich getrennten
Substanzen.
4 C. E. D a lg lie s h , Arch. Biochem. Biophysics 58, 214 [1955].
5 K. Ic h ih a ra , A. S ak am oto, K. In am ori u. Y. S akam oto, J.
Biochemistry [Tokyo] 44, 649 [1957] ; C. A. 52, 2965 a
[1958].
1
2
3
V. M itt.: Th. W ieland u. D. Grimm, Chem. Ber. 98, 1727
[1965].
Th. W ieland u. U . Gebert, Liebigs Ann. Chem. 700, 157
[1966].
S. Udenfriend, C. T. C lark , J. A xelrod u. B. B. Brodie, J.
biol. Chemistry 208, 731 [1954]; B. B. Brodie, J. Axelrod,
P. A . Shore u. S. Udenfriend 208, 741 [1954].
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Abb. 1. Elutionsdiagramm des Hydroxylie-
rungsgemischs von 150 mg Tryptophan an
240-1,1 cm Sephadex G-10 mit Wasser. Regi-
strierung mit Uvicord.
Man erkennt mehr als 10 Substanzen, die sich
— angezeigt durch die mehr oder weniger gut aus-
geprägten Erhebungen — teilweise voneinander ge-
trennt haben. Die mit
I und II bezeichneten Mi-
schungen wiesen keine charakteristischen UV-Spek-
tren auf und reagierten mit P a u 1y -Reagenz mit
wenig ausdrucksvoller bräunlicher Farbe. Sie wur-
den nicht weiter untersucht. Bei den Substanzen der
Erhebung III handelte es sich um ein Gemisdi, das
—
wie das Papierchromatogramm von Abb. 2
zeigt — einen großen Anteil einer mit Ninhydrin
rotviolett reagierenden Aminosäure enthält, die den-
selben Rf-Wert wie /?-[Oxindolyl- (3) ] -alanin (2-Hy-
droxytryptophan, la ) aufwies. Das Mischspektrum
ließ auch deutlich das bekannte6 Maximum der
Oxindolkörper bei 250 m,w und die niedrige Schul-
ter bei 280 mju erkennen, so daß wir hier die bisher
bei radikalischen Oxydationen nicht aufgefundene
Aminosäure 1 a vor uns haben dürften. Erhebung
IV bestand laut Papierchromatogramm (Abb. 2) aus
mindestens 5 in etwa gleichen Mengen vorliegenden
Ninhydrin- oder P a u 1y -positiven Substanzen, die
jedoch, da sie keine UV-spektroskopischen Anhalts-
punkte für ihre Identifizierung boten, nicht weiter
untersucht wurden. Hingegen konnte der Haupt-
Abb. 2. Absteigendes Papierchromatogramm der Fraktionen
bestandteil von Erhebung
V auf Grund des UV-
I
bis V III aus Abb. 1 mit Fließmittel LM H, 19 Stunden.
Großbuchstaben: Farbe mit a u 1y - Reagenz, Kleine Buch-
staben: Farbe mit Ninhydrin. Es bedeuten: grau, ge gelb,
Spektrums und des Papierchromatogramms leicht
als unverändertes Tryptophan (2 a) charakterisiert
werden. Aus den anderen zahlreichen Komponenten
dieser Fraktion sei nur auf die als 3 bezeichnete
Aminosäure hingewiesen, die mit P a u 1y - Reagenz
eine weinrote Färbung ergab. Diese trat eng neben
einer zu einem rostroten Farbstoff kuppelnden Ver-
P
g
v violett, b braun,
r
rot, rb rotbraun, wr weinrot, blr blaurot,
rr rostrot.
bindung (5) in der Fraktion VI als Hauptbestand-
teil auf. Das UV-Mischspektrum von Fraktion VI
deutete auf 6-Hydroxy-tryptophan (3 a )2 und 5-Hy-
6
Th. W ie la n d u. G. Schmidt, Liebigs Ann. Chem. 577, 215
[1952].
8
W ir danken Herrn Prof. Dr. B. Witkop, National Institutes
of Health, Bethesda, Md., USA, auch hier für die Über-
lassung von 5-Hydroxy-tryptophan und 6-Benzyloxy-trypto-
phan, aus dem wir durch katalytische Hydrierung über Pd-
Kohle in Methanol/Wasser (4 : 1) und anschließende Chro-
matographie an einer Sephadex G-10 Säule mit Wasser
reines 6-Hydroxy-tryptophan darstellen konnten.
7 E. T ro x le r, F. Seemann u. A. H ofm ann, Helv. chim. Acta 42,
2073 [1959],
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droxy-tryptophan (5 a )7 hin, die beide als Rein- genz erzielten Farbtöne übereinstimmten. Somit ist
substanz zur Verfügung standen 8.
wohl erwiesen, daß 5- und 6-Hydroxy-tryptophan
bei der Hydroxylierung des Tryptophans entstehen.
Als weiteres Oxydationsprodukt trat in den Frak-
tionen V II und V III eine im Papierchromatogramm
etwas rascher als 3 oder 5 wandernde Aminosäure
auf, die nach der P a u 1y -Reaktion (blaurot)
ebenfalls phenolischer Natur sein mußte (4 in Abb.
2). Wir konnten sehr wahrscheinlich machen, daß es
sich hierbei um /?-[6-Hydroxy-oxindolyl-(3) ]-alanin
(4 a) handelt, dessen UV-Spektrum aus einem Hy-
drolyseprodukt des a-Amanitins vor kurzem in Er-
scheinung getreten war 2 und das auch, abgewandelt
als 6-Methyloxyverbindung des 3-Methyl-oxindols,
als Syntheseprodukt vorlag9 (Maxima bei ca. 260,
285 mju und Schulter bei ca. 295 m/i). So ist es sehr
wahrscheinlich, daß auch die doppelt oxydierte Ver-
bindung 4 a als Produkt der Hydroxylierung des
Tryptophans gebildet wird.
Um die oxydativ gebildeten Phenole 3a und 5 a
zu trennen und zu identifizieren, haben wir versucht,
die Fraktion VI der Abb. 1 an Cellulosepulver mit
der Lösungsmittelmischung H (s. Versuchsteil) chro-
matographisch in ihre Komponenten zu zerlegen.
Dies ist zwar nicht gelungen, da die schon am Papier
wenig unterschiedlichen Stoffe auch auf der Säule
nicht differenzierter wanderten, doch konnte immer-
hin eine chromatographische Fraktion erhalten wer-
den, die nur noch aus den beiden phenolischen
Aminosäuren bestand und jetzt deutlich ein UV-
Spektrum hatte, wie es von einer Mischung aus 3a
und 5 a gegeben wird. Die Mischung zeigte im Pa-
pierchromatogramm exakt das gleiche Bild wie eine
Mischung aus 5-Hydroxy-tryptophan (5 a, Rf =
0,23) und 6-Hydroxy-tryptophan (3a, Rf = 0,20),
wobei auch die bei der Kupplung mit P a u 1y -Rea-
R
mittel aufgetrennt. Die analog Abb. 1 geschnittenen
Fraktionen, die salzfrei waren, wurden in trockenem
Zustand gewogen und ergaben die in der letzten
Spalte von Tab. 1 wiedergegebenen Ausbeuten (in
Prozenten des eingesetzten Tryptophans).
a
b
c
OH
-Gly
-Gly-Ile-Gly
Die weiteren im Papierchromatogramm (Abb. 2)
sichtbaren Oxydationsprodukte, unter denen vielleicht
auch 4- und 7-HydroxyVerbindungen zu finden wä-
ren, sind aus Mangel ^n Referenzsubstanzen nicht
weiter untersucht worden.
Um einen ungefähren Überblick über die mengen-
mäßigen Anteile an den einzelnen Oxydationspro-
dukten zu bekommen, wurde ein Hydroxylierungs-
ansatz von 300 mg Tryptophan an einer Sephadex
G-10-Säule von 1,9-240 cm mit Wasser als Elutions-
Nr. in
Abb. 2
Verbindung
Rf
(Abb. 2)
Farbe mit
P a u ly s Ninhydrin [m/i in Wasser]
Reagenz
UV-Maximum
Ausb.
[%]
rotviolett
grau-viol.
grau
251
13
48
ß- [Oxindolyl- (3) ] -alanin
Tryptophan
6-Hydroxytryptophan
ß- [6-Hydroxy-oxindolyl- (3) ] -alanin
5-Hydroxytryptophan
0,37
0,44
0,20
0,28
0,23
keine
gelb
weinrot
blaurot
rostrot
1
2
3
4
5
280,
272,
264
289
292
0,3
0,3
0,2
grau
grau
275,
295
Tab. 1. In einem Hydroxylierungsansatz von Tryptophan identifizierte Aminosäuren.
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Tryptophyl-glycyl-isoleucyl-glycin (2 c)
H y d r o x y l i e r u n g v o n T r y p t o p h y l -
p e p t i d e n
Auch das Tetrapeptid 2 c ließ nach Hydroxylie-
rung im wäßrigen System bei der anschließenden
Chromatographie an Sephadex G-10 mit Wasser
zahlreiche Uvicord-registrierte Komponenten erken-
nen, die in einer der Abb. 1 analogen Reihenfolge,
spektrophotometrisch unterscheidbar, auftraten. Im
Papierchromatogramm ergaben sich diesmal weniger
mit P a u 1y - Reagenz oder Ninhydrin anfärbbare
Flecken, doch konnten auch hier die 5-, -6 und 2.6-
Hydroxylierungsprodukte (5 c, 3 c, 4 c) eindeutig
nachgewiesen werden. Die Konzentration am Oxindo-
lyl-(3)-alanylpeptid (lc ), das durch sein UV-Spek-
trum in der Lösung noch nachzuweisen war, trat im
Papierchromatogramm nicht mehr in Erscheinung,
da seine Konzentration gegenüber den anderen Hy-
droxylierungsprodukten noch weiter als beim Di-
peptid 2 b abgefallen war.
Tryptophyl-glycin (2 b)
Der auf dem Syntheseweg zum Dipeptid 2 b ge-
legene Benzyloxycarbonyl-tryptophyl-glycinmethyl-
ester, der in Wasser/Methanol ( 2: 1 ) dem Oxyda-
tionsversuch unterzogen werden mußte, lieferte
überhaupt keine papierchromatographisch nachweis-
baren Hydroxylierungsprodukte.
Das Dipeptid
reagierte hingegen in ähnlicher Weise wie Trypto-
phan, so daß die Benzyloxycarbonylgruppe, die
wohl als Radikalfänger wirkt, für den Mißerfolg
verantwortlich sein dürfte. Am Methanol als Lö-
sungsmittel konnte das Ausbleiben der Hydroxylie-
rung nicht liegen, da — wie wir uns beim Trypto-
phan überzeugt hatten — dieser Alkohol keine hem-
mende Wirkung auf den Hydroxylierungsvorgang
ausübte. Vom Dipeptid 2 b entstanden bei gleich-
artiger Sauerstoffbehandlung wie an Tryptophan
prinzipiell analoge Hydroxylierungsprodukte. Diese
konnten in der gleichen Reihenfolge, wenn auch in
weniger scharf unterschiedenen Fraktionen, durch
Chromatographie an Sephadex G-10 in Wasser ge-
trennt werden. Die der Abb. 1 analogen Anteile wur-
den papierchromatographisch analysiert. Dabei er-
gab sich ein Bild, das dem der Oxydationsprodukte
des Tryptophans entsprach, mit dem kleinen Unter-
schied, daß jetzt die mit P a u 1y -Reagenz gleich-
farbig kuppelnden Peptide 3 b, 4 b und 5 b etwas
deutlicher waren. /?/-Werte und Ausbeuten der Oxy-
dationsprodukte sind in Tab. 2 zusammengestellt.
Zum Abschluß wurde ein analoger Hydroxylie-
rungsversuch mit 20 mg des Knollenblätterpilzgiftes
Phalloidin in Wasser ausgeführt. Trotz der geringen
Menge gelang es nach Chromatographie an Sepha-
dex G-10, in den nach dem unveränderten Toxin er-
scheinenden, UV-absorbierenden Fraktionen durch
Papierchromatographie deutlich eine Substanz auf-
zufinden, die sich durch ihre violette Farbreaktion
mit Zimtaldehyd (Phalloidin wird blau) und rote
Farbreaktion mit P a u l y s Reagenz (Phalloidin
wird schwach gelb) sowie durch ihren etwas kleine-
ren R fWert als Hydroxylierungsprodukt erwies. Ob
hier die 5-HydroxyVerbindung oder, wie in a-Ama-
nitin die 6-Hydroxyverbindung vorlag, kann erst
durch eingehendere Versuche entschieden werden.
Wie im Vergleich zum Tryptophanansatz (Tab. 1)
zu sehen ist, wuchs die Ausbeute der am Benzolkern
hydroxylierten Produkte stark an, während die
2-Hydroxylierung abfiel. Dje in der letzten Spalte
angegebenen Ausbeuten sind allerdings nur annähe-
rungsweise ermittelt.
Beschreibung der Versuche
Hydroxylierung der Tryptophankomponente aus Trypto-
phan (2 a), Tryptophyl-glycin (2 b), Tryptophyl-glycyl-
isoleucyl-glycin (2 c) und Phalloidin nach B rodie 3
Die im Hydroxylierungsgemisch (s. w. u.) gelöste
Substanz wurde im 50- oder 100-cm3-Kölbchen am
Nr.
Farbe mit
Rf
(analog
Abb. 2)
entsprechend
Abb. 2
Peptid
P a u ly s
Reagenz
Ninhydrin Ausbeute
[%]
_
ß- [Oxindolyl- (3) ] -alanyl-glycin
Tryptophylglycin
r
0,34
0,37
0,11
0,22
0,18
rotviolett
grauviolett
grau
grau
grau
3
35
11
17
12
2'
3'
4'
5'
gelb
6-Hydroxytryptophyl-glycin
ß- [6-Hydroxyoxindolyl- (3) ] -alanyl-glycin
5-Hydroxytryptophyl-glycin
weinrot
blaurot
rostrot
Tab. 2. In einem Hydroxylierungsansatz von Tryptophyl-glycin identifizierte Peptide. Die UV-Maxima entsprechen den ana-
logen Tryptophanderivaten (Tab. 1).
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Vibrator unter Durchsaugen von mit Glaswolle, konz.
Schwefelsäure und Wasser gereinigter Luft 3 Stdn. bei
37° (thermostatisiertes Wasserbad) hydroxyliert. Der
Ansatz wurde filtriert, auf 1 bis 2 cm3 eingeengt und
direkt zur Säulen- und Papierdiromatographie ver-
wendet. Hydroxylierungsgemisch: 6,5 mMol Versene
(Äthylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz) 1,3 mMol
Eisen-(II)-sulfat-7 H20, 10 mMol Ascorbinsäure, 250
ml 0,1-m. Phosphatpuffer pH 6,8; 6 mMol der Verbin-
dungen 2a—c.
als Elutionsmittel chromatographiert. Die nach dem
UV-Spektrum kontrollierten, zusammengehörigen Frak-
tionen (s. Abb. 1, S. 927) wurden vereinigt, am Rota-
tionsverdampfer auf wenige cm3 eingeengt, eisgetrock-
net und der Papierchromatographie unterworfen. Frak-
tion VI (s. Abb. 1) des Ansatzes 2 a aus Tab. 3 wurde
außerdem an 130-2,25 cm „Ederol“-Cellulosepulver
Nr. 221 chromatographiert. Im Elutionsmittel LM H
(s. w. u.) war die Fraktion III von 1100 bis 1300 cm3
Gesamt-Elutionsvolumen ein Gemisch aus 5- und 6-Hy-
droxy-tryptophan (5 a und 3 a).
Säulenchromatographie
PapierChromatographie
Die Hydroxylierungsgemische wurden an 240-1,1 cm
Sephadex G-10-Säulen unter Verwendung des „Uvicord“
Firma LKB Produkter AB, Stockholm, und eines
Fraktionssammlers in 5-cm3-Fraktionen mit Wasser
Absteigend an 60 •60 cm Schleicher & Schüll 2043 b.
Fließmittel: Lösungsmittel H (LM H) =sek.-Butylalko-
hol/Ameisensäure/Wasser (75 : 15 : 10).
Sprühreagenzien
Ver-
[m g] Versene FeS04-7H20 Ascorbin- Phosphat-
bindung
[mg]
säure
Puffer
[ccm]
P a u 1y : Frisch bereitet aus ca. 20 mg diazotierter
Sulfanilsäure in 10 cm3 10-proz. Natriumcarbonat-
lösung.
Ninhydrin: 1 g Ninhydrin auf 11 Methanol/n-Buta-
nol/2 n-Essigsäure (60 : 35 : 3).
90
50
7
615
300
48
62,5
31
305
96
550
135
42
2a
2b
50
31
2c
Zimtaldehyd/HCl 2,5-proz. methanolische Lösung.
Nach dem Sprühen 10 Min. Einhängen in einen Trog
mit HCl-Gas-Atmosphäre.
20
9
3
21
15
Phalloidin
Tab. 3. Hydroxylierungsansätze.
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