Resveratrol and trimethylated resveratrol protect from acute liver damage induced by CCI4 in the rat

Article abstract of DOI:10.1002/jat.1260

The importance of hydroxyl groups in the antioxidant and hepatoprotective properties of resveratrol was investigated. To achieve this, resveratrol or its trimethylated analog were administered (10 mg kg^-1, p.o.) to male Wistar rats and liver damage was induced by acute administration of CCl ₄ (4 g kg^-1, p.o.); appropriate controls were performed. The animals were killed 24 h after CCl₄ intoxication. The amount of reduced glutathione (GSH) in the liver was not modified by any treatment; interestingly, the GSH/GSSG (oxidized glutathione) ratio decreased in the groups receiving CCl₄ and resveratrol associated with an increase in GSSG. In blood GSH and the GSH/GSSG ratio were decreased by CCl₄; both effects were completely prevented by any of the compounds tested. Lipid peroxidation and the activity of γ-glutamyl transpeptidase were increased significantly after CCl₄. Resveratrol partially prevented these increases and surprisingly, trimethylated resveratrol completely prevented the increase of these markers. Both compounds partially but significantly prevented the increase in the activity of alanine aminotransferase; this result agrees with observations in the histological analysis. Both tested compounds administered alone produced no effect. The results of the present study suggest that OH groups are important for the antioxidant and hepatoprotective properties of the molecule of resveratrol; nevertheless, these effects can be improved by replacing hydrogen by a methyl in these groups. The differences in the antioxidant and hepatoprotective effects of these compounds could be due to the possibility that the trimethylated resveratrol acts like a prodrug, prolonging, probably, the half-life of the original compound. Copyright

Full text of DOI:10.1002/jat.1260

R E S V E R A T R O L A N D T R I M E T H Y L A T E D R E S V E R A T R O L P R E V E N T L I V E R D A M A G E 1 4 7
J O U R N A L O F A P P L I E D T O X I C O L O G Y
J . A p p l . T o x i c o l . 2 0 0 8 ; 2 8 : 1 4 7 – 1 5 5
P u b l i s h e d o n l i n e 3 1 M a y 2 0 0 7 i n W i l e y I n t e r S c i e n c e
( w w w . i n t e r s c i e n c e . w i l e y . c o m ) D O I : 1 0 . 1 0 0 2 / j a t . 1 2 6 0
Resveratrol and trimethylated resveratrol protect from
acute liver damage induced by CCl4 in the rat
Horacio Rivera,1 Mineko Shibayama,2 Victor Tsutsumi,2 Victor Perez-Alvarez1 and Pablo Muriel1,*
1
Departamento de Farmacología, Cinvestav-IPN, Apdo. Postal 14-740. México 07000, D. F. México
Departamento de Patología Experimental, Cinvestav-IPN, Apdo. Postal 14-740. México 07000, D. F. México
2
R e c e i v e d 2 3 F e b r u a r y 2 0 0 7 ; R e v i s e d 2 3 M a r c h 2 0 0 7 ; A c c e p t e d 2 4 M a r c h 2 0 0 7
A B S T R A C T : T h e i m p o r t a n c e o f h y d r o x y l g r o u p s i n t h e a n t i o x i d a n t a n d h e p a t o p r o t e c t i v e p r o p e r t i e s o f r e s v e r a t r o l
−1
w a s i n v e s t i g a t e d . T o a c h i e v e t h i s , r e s v e r a t r o l o r i t s t r i m e t h y l a t e d a n a l o g w e r e a d m i n i s t e r e d ( 1 0 m g k g , p . o . ) t o m a l e
−1
W i s t a r r a t s a n d l i v e r d a m a g e w a s i n d u c e d b y a c u t e a d m i n i s t r a t i o n o f C C l 4 ( 4 g k g , p . o . ) ; a p p r o p r i a t e c o n t r o l s w e r e
p e r f o r m e d . T h e a n i m a l s w e r e k i l l e d 2 4 h a f t e r C C l 4 i n t o x i c a t i o n . T h e a m o u n t o f r e d u c e d g l u t a t h i o n e ( G S H ) i n t h e l i v e r
w a s n o t m o d i fi e d b y a n y t r e a t m e n t ; i n t e r e s t i n g l y , t h e G S H / G S S G ( o x i d i z e d g l u t a t h i o n e ) r a t i o d e c r e a s e d i n t h e g r o u p s
r e c e i v i n g C C l 4 a n d r e s v e r a t r o l a s s o c i a t e d w i t h a n i n c r e a s e i n G S S G . I n b l o o d G S H a n d t h e G S H / G S S G r a t i o w e r e
d e c r e a s e d b y C C l 4 ; b o t h e f f e c t s w e r e c o m p l e t e l y p r e v e n t e d b y a n y o f t h e c o m p o u n d s t e s t e d . L i p i d p e r o x i d a t i o n a n d
t h e a c t i v i t y o f γ- g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e w e r e i n c r e a s e d s i g n i fi c a n t l y a f t e r C C l 4 . R e s v e r a t r o l p a r t i a l l y p r e v e n t e d t h e s e
i n c r e a s e s a n d s u r p r i s i n g l y , t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l c o m p l e t e l y p r e v e n t e d t h e i n c r e a s e o f t h e s e m a r k e r s . B o t h c o m p o u n d s
p a r t i a l l y b u t s i g n i fi c a n t l y p r e v e n t e d t h e i n c r e a s e i n t h e a c t i v i t y o f a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ; t h i s r e s u l t a g r e e s w i t h
o b s e r v a t i o n s i n t h e h i s t o l o g i c a l a n a l y s i s . B o t h t e s t e d c o m p o u n d s a d m i n i s t e r e d a l o n e p r o d u c e d n o e f f e c t . T h e r e s u l t s o f
t h e p r e s e n t s t u d y s u g g e s t t h a t O H g r o u p s a r e i m p o r t a n t f o r t h e a n t i o x i d a n t a n d h e p a t o p r o t e c t i v e p r o p e r t i e s o f t h e
m o l e c u l e o f r e s v e r a t r o l ; n e v e r t h e l e s s , t h e s e e f f e c t s c a n b e i m p r o v e d b y r e p l a c i n g h y d r o g e n b y a m e t h y l i n t h e s e g r o u p s .
T h e d i f f e r e n c e s i n t h e a n t i o x i d a n t a n d h e p a t o p r o t e c t i v e e f f e c t s o f t h e s e c o m p o u n d s c o u l d b e d u e t o t h e p o s s i b i l i t y
t h a t t h e t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l a c t s l i k e a p r o d r u g , p r o l o n g i n g , p r o b a b l y , t h e h a l f - l i f e o f t h e o r i g i n a l c o m p o u n d .
C o p y r i g h t © 2 0 0 7 J o h n W i l e y & S o n s , L t d .
K E Y W O R D S : r e s v e r a t r o l ; l i v e r i n j u r y ; c a r b o n t e t r a c h l o r i d e ; n e c r o s i s ; i n fl a m m a t i o n ; l i p i d p e r o x i d a t i o n ; g l u t a t h i o n e ; r e s v e r a t r o l
a n a l o g s ; l i v e r d a m a g e
Introduction
R e s v e r a t r o l a l s o i m p r o v e s i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n - i n d u c e d
o x i d a t i v e r e n a l i n j u r y i n r a t s ( S e n e r e t a l . , 2 0 0 6 b )
a n d a c e t a m i n o p h e n - i n d u c e d t o x i c i t y i n m i c e ( S e n e r
e t a l . , 2 0 0 6 a ) . I n a d d i t i o n , t h i s c o m p o u n d p r o t e c t s a g a i n s t
o x i d a t i v e s t r e s s i n c h o l e s t a s i s ( A r a e t a l . , 2 0 0 5 ) a n d i n
e t h a n o l - i n d u c e d l i p i d p e r o x i d a t i o n i n r a t s ( K a s d a l l a h -
G r i s s a e t a l . , 2 0 0 6 ) .
T h e s t r u c t u r a l d e t e r m i n a n t s o f t h e s e p r o p e r t i e s o f t h e
r e s v e r a t r o l m o l e c u l e a r e o b s c u r e , b u t t h e n u m b e r a n d
p o s i t i o n o f t h e h y d r o x y l g r o u p s h a v e b e e n s u g g e s t e d
t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e a n t i o x i d a n t a c t i v i t y
( F a u c o n n e a u e t a l . , 1 9 9 7 ; K a w a d a e t a l . , 1 9 9 8 ; F r e m o n t ,
2 0 0 0 ) . H o w e v e r , a l l t h e s e s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d i n v i t r o .
F u r t h e r m o r e , t h e e f f e c t s o f r e s v e r a t r o l o r a n y a n a l o g h a v e
n o t b e e n t e s t e d i n t h e m o d e l o f a c u t e l i v e r d a m a g e i n -
d u c e d b y C C l 4 . A c u t e i n t o x i c a t i o n w i t h t h i s a g e n t i n r a t s
o r m i c e i s f r e q u e n t l y u s e d t o p r o d u c e t o x i c h e p a t i t i s i n
o r d e r t o t e s t p o s s i b l e h e p a t o p r o t e c t i v e a g e n t s , m a i n l y
t h o s e w i t h a n t i o x i d a n t p r o p e r t i e s , a n d t o s t u d y l i v e r r e -
g e n e r a t i o n a f t e r a c h e m i c a l h e p a t e c t o m y ( M u r i e l , 2 0 0 7 ) .
T h e r e f o r e , i n t h e p r e s e n t w o r k t h e e f f e c t o f r e s v e r a t r o l
o n a c u t e l i v e r d a m a g e i n d u c e d b y C C l 4 i n t o x i c a t i o n w a s
s t u d i e d . I n a d d i t i o n t h e i m p o r t a n c e o f t h e h y d r o x y l
g r o u p s i n t h e a n t i o x i d a n t a n d h e p a t o p r o t e c t i v e p r o p e r t i e s
R e s v e r a t r o l ( 3 , 4 ′, 5 - t r i h y d r o x y s t i l b e n e ) i s s y n t h e s i z e d b y
s e v e r a l p l a n t s i n r e s p o n s e t o a d v e r s e c o n d i t i o n s s u c h a s
e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r p a t h o g e n i c a t t a c k . F o r t h i s r e a s o n ,
i t i s c l a s s i fi e d a s a p h y t o a l e x i n , a c l a s s o f a n t i b i o t i c s
o f p l a n t o r i g i n . T h i s p h y t o a l e x i n i s p r e s e n t i n g r a p e s ,
p e a n u t s , m u l b e r r i e s a n d r e d w i n e a n d p o s s e s s e s v a r i o u s
p h a r m a c o l o g i c a l e f f e c t s i n c l u d i n g a n t i - i n fl a m m a t o r y p r o p -
e r t i e s , m o d u l a t i o n o f l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d p r e v e n t i o n
o f c a n c e r ( B u r k i t t a n d D u n c a n , 2 0 0 0 ; S g a m b a t o e t a l . ,
2 0 0 1 ) . I t s a n t i - i n fl a m m a t o r y e f f e c t i s r e l a t e d t o i n h i b i t i n g
o x i d a t i o n , l e u k o c y t e p r i m i n g a n d e x p r e s s i o n o f i n fl a m m a -
t o r y m e d i a t o r s . R e c e n t l y , i t h a s b e e n f o u n d t o p r e v e n t
a n d c u r e c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e s a n d t o i m p r o v e m i c r o -
c i r c u l a t o r y d i s o r d e r s b y p r o t e c t i n g t h e v a s c u l a r e n d o -
t h e l i u m , m o d u l a t i o n o f l i p i d m e t a b o l i s m , a n d i n c r e a s i n g
c e l l u l a r n i t r i c o x i d e l e v e l s , a s w e l l a s i n h i b i t i n g p l a t e l e t
a g g r e g a t i o n ( W u e t a l . , 2 0 0 1 ; W a l l e r a t h e t a l . , 2 0 0 2 ) .
*
C o r r e s p o n d e n c e t o : D r P a b l o M u r i e l , D e p a r t a m e n t o d e F a r m a c o l o g í a ,
C i n v e s t a v - I P N , A p d o . P o s t a l 1 4 - 7 4 0 , M é x i c o 0 7 0 0 0 , D . F . M é x i c o .
E - m a i l : p a m u r i e l @ c i n v e s t a v . m x
C o n t r a c t / g r a n t s p o n s o r : C o n a c y t .
C o p y r i g h t © 2 0 0 7 J o h n W i l e y & S o n s , L t d .
J . A p p l . T o x i c o l . 2 0 0 8 ; 2 8 : 1 4 7 – 1 5 5
D O I : 1 0 . 1 0 0 2 / j a t

1 4 8 H . R I V E R A E T A L .
o f r e s v e r a t r o l w e r e i n v e s t i g a t e d b y b l o c k i n g t h e O H
g r o u p s b y m e t h y l a t i n g a l l o f t h e m . I t w a s f o u n d t h a t b o t h
c o m p o u n d s a f f o r d e d s o m e d e g r e e o f p r o t e c t i o n , b u t , s u r -
p r i s i n g l y , t h e t r i m e t h y l a t e d a n a l o g s h o w e d t h e b e s t e f f e c t .
T h i s m a y b e e x p l a i n e d b e c a u s e t h e h a l f - l i f e o f r e s v e r a t r o l
i s v e r y s h o r t ( W a l l e e t a l . , 2 0 0 4 ) a n d t r i m e t h y l a t e d
r e s v e r a t r o l m a y a c t a s a p r o d r u g i n c r e a s i n g t h e d u r a t i o n
o f t h e e f f e c t o f r e s v e r a t r o l ; a l t e r n a t i v e l y , t r i m e t h y l a t e d
r e s v e r a t r o l m a y b e m o r e p o t e n t t h a n r e s v e r a t r o l b y i t s e l f .
h o u s e d f o u r o r fi v e p e r p o l y c a r b o n a t e c a g e a n d w e r e k e p t
u n d e r c o n t r o l l e d c o n d i t i o n s o f 2 2 2 ° C , 5 0 – 6 0 % r e l a -
t i v e h u m i d i t y a n d 1 2 h l i g h t - d a r k c y c l e s . A l l a n i m a l s
r e c e i v e d h u m a n e c a r e a n d t h e s t u d y c o m p l i e s w i t h t h e i n -
s t i t u t i o n ’ s g u i d e l i n e s a n d t h e M e x i c a n o f fi c i a l r e g u l a t i o n
( N O M - 0 6 2 - Z O O - 1 9 9 9 ) r e g a r d i n g t e c h n i c a l s p e c i fi c a t i o n s
f o r p r o d u c t i o n , c a r e a n d u s e o f l a b o r a t o r y a n i m a l s .
T h e r a t s w e r e d i v i d e d i n t o s i x g r o u p s o f s i x r a t s
e a c h . G r o u p I c o n s i s t e d o f c o n t r o l a n i m a l s t h a t r e c e i v e d
v e h i c l e o n l y ( 0 . 1 m l o f m i n e r a l o i l , p . o . ) w h i c h s e r v e d a s
a c o n t r o l . I n g r o u p I I , a c u t e l i v e r d a m a g e w a s p r o d u c e d
−1
Materials and Methods
b y p . o . a d m i n i s t r a t i o n o f C C l 4 ( 4 g k g ) d i s s o l v e d i n
m i n e r a l o i l . I n g r o u p I I I t h e r a t s r e c e i v e d C C l 4 a s m e n -
t i o n e d a b o v e a n d a l s o r e c e i v e d o r a l r e s v e r a t r o l t r e a t m e n t
Materials
−1
( 1 0 m g k g ) 2 h b e f o r e a n d 2 h a f t e r C C l 4 a d m i n i s t r a t i o n .
R e s v e r a t r o l , m e t h y l i o d i d e , c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e , t h i o -
b a r b i t u r i c a c i d , γ- g l u t a m y l - p - n i t r o a n i l i d e , L - γ- g l u t a m y l - p -
n i t r o a n i l i n e , p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e a n d b o v i n e s e r u m
a l b u m i n w e r e p u r c h a s e d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o m -
p a n y ( S t L o u i s , M O , U S A ) . C a r b o n t e t r a c h l o r i d e , s o d i u m
a c e t a t e , e t h y l a c e t a t e , e t h y l e t h e r , a c e t o n e , h e x a n e ,
s o d i u m h y d r o x i d e , p o t a s s i u m c a r b o n a t e , g l a c i a l a c e t i c
a c i d , h y d r o c h l o r i c a c i d , s u l f u r i c a c i d , e t h a n o l , m e t h a n o l ,
p o t a s s i u m h y d r o x i d e a n d f o r m a l d e h y d e w e r e o b t a i n e d
f r o m J . T . B a c k e r ( X a l o s t o c , M e x i c o ) .
A n i m a l s i n g r o u p I V r e c e i v e d a s i m i l a r t r e a t m e n t t o t h o s e
i n g r o u p I I I b u t r e c e i v e d t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l i n s t e a d
o f r e s v e r a t r o l . G r o u p s V a n d V I c o n s i s t e d o f a p p r o p r i a t e
c o n t r o l s o f r e s v e r a t r o l a n d t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l . A
−1
d o s e o f 1 0 m g k g w a s c h o s e n b e c a u s e t h i s d o s e w a s
v e r y e f f e c t i v e a g a i n s t l i v e r d a m a g e i n d u c e d b y c h o l e s t a s i s
( A r a e t a l . , 2 0 0 5 ) . R e s v e r a t r o l o r t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l
w e r e n o t s o l u b l e i n w a t e r , t h e r e f o r e t h e y w e r e a d m i n i s -
t e r e d s u s p e n d e d i n 0 . 7 % o f c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e .
Biochemical Estimations
Synthesis of Trimethylated Resveratrol
A n i m a l s w e r e k i l l e d 2 4 h a f t e r C C l 4 a d m i n i s t r a t i o n u n d e r
l i g h t e t h e r a n e s t h e s i a ; b l o o d w a s c o l l e c t e d b y c a r d i a c
p u n c t u r e a n d t h e l i v e r w a s r a p i d l y r e m o v e d . S e r u m w a s
o b t a i n e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f l i v e r d a m a g e b y m e a s u r -
i n g t h e a c t i v i t i e s o f γ- g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e ( γ- G T P )
( G l o s s m a n a n d N e v i l l e , 1 9 7 2 ) a n d a l a n i n e a m i n o t r a n s -
f e r a s e ( A L T ) ( R e i t m a n a n d F r a n k e l , 1 9 5 7 ) .
T r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l ( 3 , 4 ′, 5 - t r a n s - t r i m e t h o x y s t i l b e n e )
w a s s y n t h e s i z e d b y d i r e c t m e t h y l a t i o n u s i n g t h e m e t h o d
r e p o r t e d p r e v i o u s l y b y S t i v a l a a n d c o w o r k e r s ( 2 0 0 1 ) , t h e
c o m p o u n d w a s p u r i fi e d u n d e r o u r o w n c o n d i t i o n s . A m i x -
t u r e o f 1 g o f t r a n s - r e s v e r a t r o l ( 4 . 4 m m o l ) a n d 5 . 8 m l o f
C H I ( 9 2 . 4 m m o l ) w e r e r e fl u x e d f o r 8 h i n a c e t o n e ( 1 5 0 m l )
3
i n t h e p r e s e n c e o f 9 . 1 g o f a n h y d r o u s p o t a s s i u m c a r b o n a t e
( 6 6 m m o l ) . O n c e c o n c l u d e d a t t h e e s t a b l i s h e d t i m e , e t h y l
e t h e r w a s a d d e d a n d t h e s o l u t i o n w a s w a s h e d w i t h w a t e r .
T h e o r g a n i c p h a s e w a s d r i e d w i t h a n h y d r o u s s o d i u m s u l -
p h a t e . T h e s o d i u m s u l p h a t e w a s w a s h e d w i t h e t h y l e t h e r
a n d t h e w a t e r y p h a s e w a s r e j e c t e d . E t h y l e t h e r i n t h e o r g a n i c
p h a s e w a s r e m o v e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e t o o b t a i n a
v i s c o u s y e l l o w o i l t h a t c r y s t a l l i z e d b y f r e e z i n g , g i v i n g
3 , 4 ′, 5 - t r a n s - t r i m e t h o x y s t i l b e n e i n 8 3 % y i e l d ( m . p . 5 2 –
5 4 ° C ) . T h e l e n g t h o f t h e m . p . o f a g i v e n c o m p o u n d i s a
g o o d i n d i c a t o r o f i t s p u r i t y . A s h o r t l e n g t h m . p . ( o f a b o u t
2 ° C ) i n d i c a t e s t h a t t h e c o m p o u n d i s p u r e . I n t h e p r e s e n t
w o r k , t h e m . p . o f t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l w a s 5 2 – 5 4 ° C ,
i n d i c a t i n g t h a t t h e p u r i t y o f t h e c o m p o u n d w a s h i g h .
Assessment of Lipid Peroxidation
T h e e x t e n t o f l i p i d p e r o x i d a t i o n w a s e s t i m a t e d i n l i v e r
h o m o g e n a t e s b y m e a s u r e m e n t o f m a l o n d i a l d e h y d e ( M D A )
f o r m a t i o n u s i n g t h e t h i o b a r b i t u r i c a c i d m e t h o d ( O k a w a
e t a l . , 1 9 7 9 ) . P r o t e i n w a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o B r a d f o r d
( 1 9 7 6 ) u s i n g b o v i n e s e r u m a l b u m i n a s s t a n d a r d .
Reduced and Oxidized Glutathione
Determinations in Liver
G S H a n d G S S G w e r e p r e p a r e d d a i l y i n 0 . 1 M s o d i u m
p h o s p h a t e 0 . 0 0 5 M E D T A b u f f e r ( p H 8 . 0 ) a n d k e p t
o n i c e u n t i l u s e d . O - p h t h a l d i a l d e h y d e ( O P T ) s o l u t i o n
w a s p r e p a r e d d a i l y i n r e a g e n t - g r a d e a b s o l u t e m e t h a n o l
( 1 m g m l −1 ) j u s t p r i o r t o u s e .
Treatment of Animals
M a l e W i s t a r r a t s w e i g h i n g 2 0 0 – 2 5 0 g w e r e u s e d i n t h i s
s t u d y . T h e y w e r e m a i n t a i n e d o n s t a n d a r d r a t c h o w d i e t
w i t h f r e e a c c e s s t o d r i n k i n g w a t e r . T h e a n i m a l s w e r e
L i v e r s a m p l e s w e r e h o m o g e n i z e d o n i c e u s i n g a p o l y -
t r o n h o m o g e n i z e r . T h e s o l u t i o n u s e d f o r h o m o g e n i z a t i o n
C o p y r i g h t © 2 0 0 7 J o h n W i l e y & S o n s , L t d .
J . A p p l . T o x i c o l . 2 0 0 8 ; 2 8 : 1 4 7 – 1 5 5
D O I : 1 0 . 1 0 0 2 / j a t

R E S V E R A T R O L A N D T R I M E T H Y L A T E D R E S V E R A T R O L P R E V E N T L I V E R D A M A G E 1 4 9
c o n s i s t e d o f 3 . 7 5 m l o f t h e p h o s p h a t e - E D T A b u f f e r a n d
1 m l o f 2 5 % H P O , w h i c h w a s u s e d a s a p r o t e i n p r e c i p i -
t a n t . T h e t o t a l h o m o g e n a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 4 ° C a t
1 0 0 0 0 0 g f o r 2 0 m i n t o o b t a i n t h e s u p e r n a n t f o r t h e
a s s a y o f G S H a n d G S S G .
T h e n t h e y w e r e w a s h e d w i t h t a p w a t e r , d e h y d r a t e d i n
a l c o h o l a n d e m b e d d e d i n p a r a f fi n . S e c t i o n s o f 6 – 7 μm
w e r e m o u n t e d i n g l a s s s l i d e s c o v e r e d w i t h s i l a n e . H e m a t -
o x y l i n a n d e o s i n s t a i n s w e r e p e r f o r m e d o n e a c h s l i d e .
3
4
D e t e r m i n a t i o n o f G S H w a s p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o
H i s s i n a n d H i l f ( 1 9 7 6 ) . T o 0 . 0 5 m l o f t h e 1 0 0 0 0 0 g
s u p e r n a t a n t , 4 . 5 m l o f t h e p h o s p h a t e - E D T A b u f f e r p H 8 . 0
w a s a d d e d . T h e fi n a l a s s a y m i x t u r e ( 2 . 0 m l ) c o n t a i n e d
1 0 0 μl o f t h e d i l u t e d t i s s u e s u p e r n a t a n t , 1 . 8 m l o f
p h o s p h a t e - E D T A b u f f e r , a n d 1 0 0 μl o f t h e O P T s o l u t i o n ,
c o n t a i n i n g 1 0 0 μg o f O P T . A f t e r t h o r o u g h m i x i n g
a n d i n c u b a t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 5 m i n , t h e s o l u -
t i o n w a s t r a n s f e r r e d t o a q u a r t z c u v e t t e . F l u o r e s c e n c e a t
4 2 0 n m w a s d e t e r m i n e d w i t h a c t i v a t i o n a t 3 5 0 n m .
I n t h e G S S G a s s a y , a 0 . 5 m l p o r t i o n o f t h e o r i g i n a l
1 0 0 0 0 0 g s u p e r n a t a n t w a s i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e
w i t h 2 0 0 μl o f 0 . 0 4 M N - e t h y l m a l e i m i d e ( N E M ) f o r
2 0 m i n t o i n t e r a c t w i t h t h e G S H p r e s e n t i n t h e t i s s u e . T o
t h i s m i x t u r e , 4 . 3 m l o f 0 . 1 N N a O H w a s a d d e d . A 1 0 0 μl
p o r t i o n o f t h i s m i x t u r e w a s t a k e n f o r m e a s u r e m e n t o f
G S S G , a s o u t l i n e d a b o v e f o r t h e G S H a s s a y , e x c e p t
t h a t 0 . 1 N N a O H w a s e m p l o y e d a s a d i l u e n t r a t h e r t h a n
p h o s p h a t e - E D T A b u f f e r .
Statistical Analysis
D a t a a r e e x p r e s s e d a s m e a n v a l u e S E M . C o m p a r i s o n s
w e r e c a r r i e d o u t b y a n a l y s i s o f v a r i a n c e f o l l o w e d b y
D u n n e t t ’ s o r T u k e y ’ s t e s t , a s a p p r o p r i a t e , u s i n g S i g m a
S t a t f o r W i n d o w s ( 2 . 0 V e r s i o n ) . D i f f e r e n c e s w e r e c o n -
s i d e r e d s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t w h e n P < 0 . 0 5 .
Results
F i g u r e 1 d e p i c t s t h e p r o t o n n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e
1
H N M R
1
( H N M R ) o f t h e t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l .
( C D C l 3 , 3 0 0 M H z ) : δ 3 . 8 3 ( s , 9 H , 3 X O C H 3 ) ; 6 . 3 9
( d d , 1 H , J 4 , 2 = J 4 , 6 = 2 . 2 H z , H - 4 ) ; 6 . 6 7 ( d , 2 H , J 2 , 4 =
J 2 , 6 = 2 . 2 , H - 2 a n d H - 6 ) ; 6 . 9 4 a n d 7 . 0 8 ( A B s y s t e m , 2 H ,
J = 1 6 . 2 2 H z , C H = C H ) ; 6 . 9 2 ( d , 2 H , J 3 ′, 2 ′ = J 5 ′, 6 ′
= 8 . 8 H z , H - 3 ′ a n d H - 5 ′) ; 7 . 4 7 ( d , 2 H , J 2 ′, 3 ′ = J 6 ′, 5 ′
= 8 . 8 H z , H - 2 ′ a n d H - 6 ′) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t
t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l w a s s u c c e s s f u l l y s y n t h e s i z e d .
Histology
F i g u r e 2 d e p i c t s t h e f o r m u l a o f b o t h m o l e c u l e s
r e s v e r a t r o l a n d t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l . T h e o n l y d i f f e r -
e n c e b e t w e e n t h e c o m p o u n d s w a s t h a t i n t h e s e c o n d ,
o n e h y d r o g e n f r o m t h e t h r e e h y d r o x y l g r o u p s w a s
S a m p l e s w e r e t a k e n f r o m a l l t h e a n i m a l s a n d fi x e d w i t h
1 0 % f o r m a l d e h y d e i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e f o r 2 4 h .
Figure 1. 1H nuclear magnetic resonance of trimethylated resveratrol
C o p y r i g h t © 2 0 0 7 J o h n W i l e y & S o n s , L t d .
J . A p p l . T o x i c o l . 2 0 0 8 ; 2 8 : 1 4 7 – 1 5 5
D O I : 1 0 . 1 0 0 2 / j a t

1 5 0 H . R I V E R A E T A L .
r e s v e r a t r o l o r t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l c o n t a i n e d e l e v a t e d
a m o u n t s o f G S S G a n d G S H + G S S G ( F i g . 3 ) .
I n b l o o d , C C l 4 d r a m a t i c a l l y d e c r e a s e d G S H , G S H /
G S S G a n d G S H + G S S G , w h i l e G S S G r e m a i n e d w i t h o u t
c h a n g e s . B o t h r e s v e r a t r o l a n d i t s t r i m e t h y l a t e d a n a l o g
c o m p l e t e l y p r e s e r v e d t h e c o n t r o l c o n t e n t o f G S H , G S H /
G S S G a n d G S H + G S S G , i n d i c a t i n g a t o t a l h y d r o p h i l i c
a n t i o x i d a n t p r o t e c t i o n i n b l o o d ( F i g . 4 ) .
F i g u r e 5 s h o w s t h e d e g r e e o f l i p i d p e r o x i d a t i o n b y
m e a s u r i n g o n e o f i t s e n d p r o d u c t s , m a l o n d i a l d e h y d e
( M D A ) . A c u t e C C l 4 i n t o x i c a t i o n s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e d
t h e l i v e r c o n t e n t o f M D A ; t r e a t m e n t w i t h r e s v e r a t r o l
p r e v e n t e d p a r t i a l l y t h e i n c r e a s e i n t h e d e g r e e o f l i p i d
p e r o x i d a t i o n . I n t e r e s t i n g l y , t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l c o m -
p l e t e l y p r e s e r v e d t h e c o n t r o l c o n t e n t o f l i v e r M D A .
T h e s e r u m e n z y m e a c t i v i t y o f γ- g l u t a m y l t r a n s p e p t i -
d a s e i s a w e l l r e c o g n i z e d m a r k e r o f c h o l e s t a s i s ; t h i s
e n z y m e i s n o r m a l l y e m b e d d e d i n t h e h e p a t o c y t e p l a s m a
m e m b r a n e , m a i n l y i n t h e c a n a l i c u l a r d o m a i n ; t h e l i b e r a -
t i o n o f γ- g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e t o s e r u m i n d i c a t e s d a m -
a g e t o t h e c e l l a n d t h u s i n j u r y t o t h e l i v e r . I t i s i m p o r t a n t
t o p o i n t o u t t h a t s e r u m a c t i v i t y o f t h i s e n z y m e i s c o n -
s i d e r e d o n e o f t h e b e s t i n d i c a t o r s o f c h o l e s t a s i s ( R o s e n
a n d K e e f f e , 2 0 0 0 ) . T h e s e r u m a c t i v i t y o f γ- g l u t a m y l
Figure 2. Resveratrol and trimethylated resveratrol
molecular structures
s u b s t i t u t e d b y a m e t h y l g r o u p , t h e r e f o r e i n t e r f e r i n g w i t h
e l e c t r o n r e s o n a n c e a n d d e c r e a s i n g t h e a b i l i t y o f t h e
m o l e c u l e t o s c a v e n g e f r e e r a d i c a l s i n v i t r o ( S t i v a l a e t a l . ,
2 0 0 1 ) .
L i v e r r e d u c e d ( G S H ) , o x i d i z e d ( G S S G ) , G S H / G S S G
r a t i o a n d t o t a l ( G S H + G S S G ) g l u t a t h i o n e a r e d e p i c t e d i n
F i g . 3 . G S H w a s n o t m o d i fi e d b y a n y t r e a t m e n t ; h o w -
e v e r , t h e r e s v e r a t r o l p l u s C C l 4 g r o u p s h o w e d a d e c r e a s e d
v a l u e o f G S H / G S S G . T h e g r o u p s r e c e i v i n g C C l 4 p l u s
Figure 3. Reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione, GSH/GSSG ratio and total glutathione (GSH + GSSG)
determined in livers from control rats, CCl4 treated rats (CCl4), CCl4 plus resveratrol (RSV) treated rats (CCl4 + RSV),
and rats treated with trimethylated resveratrol (MeRSV) in addition to CCl4. Each bar represents the mean value
a
of experiments performed in duplicate assays
Significantly different from CCl4 group, P < 0.05
SEM (n = 6). Significantly different from control, P < 0.05.
b
C o p y r i g h t © 2 0 0 7 J o h n W i l e y & S o n s , L t d .
J . A p p l . T o x i c o l . 2 0 0 8 ; 2 8 : 1 4 7 – 1 5 5
D O I : 1 0 . 1 0 0 2 / j a t

R E S V E R A T R O L A N D T R I M E T H Y L A T E D R E S V E R A T R O L P R E V E N T L I V E R D A M A G E 1 5 1
Figure 4. Reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione, GSH/GSSG ratio and total glutathione (GSH + GSSG)
determined in blood from control rats, CCl4 treated rats (CCl4), CCl4 plus resveratrol (RSV) treated rats (CCl4 + RSV),
and rats treated with trimethylated resveratrol (MeRSV) in addition to CCl4. Each bar represents the mean value
a
of experiments performed in duplicate assays
Significantly different from CCl4 group, P < 0.05
SEM (n = 6). Significantly different from control, P < 0.05.
b
t r a n s p e p t i d a s e i n c r e a s e d m o r e t h a n 5 - t i m e s a f t e r C C l 4
a d m i n i s t r a t i o n ; a p a r t i a l b u t v e r y m a r k e d p r e v e n t i o n o f
t h e e l e v a t i o n o f t h i s e n z y m e w a s a f f o r d e d b y r e s v e r a t r o l .
A g a i n , t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l c o m p l e t e l y p r e s e r v e d t h e
i n c r e a s e i n t h i s m a r k e r o f l i v e r d a m a g e ( F i g . 6 ) .
A l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e i s a c y t o s o l i c e n z y m e o f
t h e h e p a t o c y t e a n d a n i n c r e a s e o f e n z y m e a c t i v i t y r e fl e c t s
a n i n c r e a s e i n p l a s m a m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y , w h i c h ,
i n t u r n , i s a s s o c i a t e d w i t h c e l l d e a t h ( R o s e n a n d K e e f f e ,
2 0 0 0 ) . T h i s e n z y m e a c t i v i t y w a s i n c r e a s e d n e a r l y 3 - t i m e s
b y C C l 4 . I n t h i s c a s e b o t h r e s v e r a t r o l a n d t r i m e t h y l a t e d
r e s v e r a t r o l a f f o r d e d t h e s a m e p a r t i a l b u t s i g n i fi c a n t
p r o t e c t i o n ( F i g . 7 ) .
F i g u r e 8 d e p i c t s h e m a t o x y l i n a n d e o s i n r e p r e s e n t a t i v e
s t a i n e d s e c t i o n s o f t h e l i v e r . P a n e l A r e p r e s e n t s a c o n t r o l
r a t l i v e r w h e r e t h e a r c h i t e c t u r e o f t h e h e p a t i c p a r e n c h y m a
i s n o r m a l . P a n e l B s h o w s a l i v e r d a m a g e d b y C C l 4 ,
w h e r e l a r g e a r e a s o f n e c r o s i s c a n b e o b s e r v e d ; i n fi l t r a t i o n
o f i n fl a m m a t o r y c e l l s i s a l s o e v i d e n t . P a n e l s C a n d D
c o r r e s p o n d t o l i v e r s f r o m r e s v e r a t r o l a n d t r i m e t h y l a t e d
r e s v e r a t r o l p l u s C C l 4 t r e a t e d a n i m a l s ; i n b o t h c a s e s a
Figure 5. Degree of lipid peroxidation expressed
as the content of malondialdehyde (MDA) determined
in livers from control rats, CCl4 treated rats (CCl4), CCl4
plus resveratrol (RSV) treated rats (CCl4 + RSV), and
rats treated with trimethylated resveratrol (MeRSV) in
addition to CCl4. Each bar represents the mean value
of experiments performed in duplicate assays
(n = 6). Significantly different from control, P < 0.05.
SEM
a
b
Significantly different from CCl4 group, P < 0.05
C o p y r i g h t © 2 0 0 7 J o h n W i l e y & S o n s , L t d .
J . A p p l . T o x i c o l . 2 0 0 8 ; 2 8 : 1 4 7 – 1 5 5
D O I : 1 0 . 1 0 0 2 / j a t

1 5 2 H . R I V E R A E T A L .
Discussion
R e s v e r a t r o l p r o t e c t e d p a r t i a l l y f r o m o x i d a t i v e s t r e s s , t h e
n e c r o s i s a n d c h o l e s t a s i s i n d u c e d b y a c u t e C C l 4 i n t o x i c a -
t i o n . A d m i n i s t r a t i o n o f t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l r e s u l t e d
i n a n i n c r e a s e d p r o t e c t i v e e f f e c t m a i n l y o n t h e d e g r e e o f
l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d γ- g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e s e r u m
a c t i v i t y .
C a r b o n t e t r a c h l o r i d e ( C C l 4 ) o n c e w a s u s e d w i d e l y a s a
s o l v e n t , c l e a n e r a n d d e g r e a s e r b o t h f o r i n d u s t r i a l a n d
h o m e u s e . T o d a y , t h e s c i e n t i fi c d a t a b a s e o n t h e e f f e c t s o f
h a l o a l k a n e s i s s o v a s t t h a t i t i s n o l o n g e r u s e d , a n d o n l y
a s a m o d e l o f e x p e r i m e n t a l l i v e r i n j u r y ( W e b e r e t a l . ,
2 0 0 3 ) . C C l 4 p r o v e s h i g h l y u s e f u l a s a n e x p e r i m e n t a l
m o d e l f o r t h e s t u d y o f c e r t a i n h e p a t o t o x i c e f f e c t s
( M u r i e l , 1 9 9 7 , 2 0 0 7 ) . I t c o n s i s t e n t l y p r o d u c e s l i v e r i n j u r y
i n m a n y s p e c i e s , i n c l u d i n g n o n - h u m a n p r i m a t e s ( Y o s h i d a
e t a l . , 1 9 9 9 ) .
Figure 6. Enzymatic activity of γ-glutamyl transpepti-
dase measured in serum derived from control rats, CCl4
treated rats (CCl4), CCl4 plus resveratrol (RSV) treated
rats (CCl4 + RSV), and rats treated with trimethylated
resveratrol (MeRSV) in addition to CCl4. Each bar repre-
sents the mean value of experiments performed in
a
C a r b o n t e t r a c h l o r i d e m e t a b o l i s m b e g i n s w i t h t h e
f o r m a t i o n o f t h e t r i c h l o r o m e t h y l f r e e r a d i c a l , C C l 3
duplicate assays SEM (n = 6). Significantly different
•
b
from control, P < 0.05. Significantly different from
CCl4 group, P < 0.05
t h r o u g h t h e a c t i o n o f t h e m i x e d f u n c t i o n c y t o c h r o m e
P 4 5 0 o x y g e n a s e s y s t e m o f t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m .
T h i s p r o c e s s i n v o l v e s r e d u c t i v e c l e a v a g e o f a c a r b o n –
c h l o r i n e b o n d . T h e m a j o r c y t o c h r o m e i s o z y m e t o e x e c u t e
b i o t r a n s f o r m a t i o n o f C C l 4 i s C Y P 2 E 1 , b u t C Y P 2 B 1 a n d
C Y P 2 B 2 a r e a l s o a b l e t o a t t a c k t h e C C l 4 m o l e c u l e
( M u r i e l , 2 0 0 7 ) .
•
T h e C C l 3 , i n t h e p r e s e n c e o f o x y g e n , i s t r a n s f o r m e d
•
i n t o t h e t r i c h l o r o m e t h y l p e r o x y r a d i c a l , C C l 3 O O . T h i s
r a d i c a l i s m o r e r e a c t i v e a n d t h u s s h o r t e r l i v e d t h a n t h e
•
C C l 3 r a d i c a l ( M i c o a n d P o h l , 1 9 8 3 ) . T h e l i f e t i m e o f
•
t h e C C l 3 O O r a d i c a l i s i n t h e m i l l i s e c o n d r a n g e a n d i t
d i s a p p e a r s f r o m t h e t i s s u e b y r e a c t i n g w i t h s u i t a b l e
•
s u b s t r a t e s t o c o m p l e t e i t s e l e c t r o n p a i r . C C l 3 O O i s m o r e
•
l i k e l y t h a n C C l 3 t o a b s t r a c t h y d r o g e n f r o m p o l y u n s a t u -
r a t e d f a t t y a c i d s ( P U F A ) ( F o r n i e t a l . , 1 9 8 3 ) l e a d i n g
t o l i p i d p e r o x i d a t i o n ( M u r i e l , 1 9 9 7 ) . T h e a b s t r a c t i o n
o f h y d r o g e n f r o m P U F A s t a r t s s e q u e n t i a l r e a c t i o n s t h a t
fi n i s h i n t h e c o m p l e t e d i s i n t e g r a t i o n o f t h e f a t t y a c i d
m o l e c u l e s w i t h t h e c o n s e q u e n t f o r m a t i o n o f a l d e h y d e s ,
o t h e r c a r b o n y l s a n d a l k a n e s i n a p r o c e s s c a l l e d l i p i d
p e r o x i d a t i o n . I t i s i m p o r t a n t t o p o i n t o u t t h a t l i p i d
p e r o x i d a t i o n m a y p r o d u c e i n j u r y b y c o m p r o m i s i n g t h e
i n t e g r i t y o f m e m b r a n e s a n d b y c o v a l e n t b i n d i n g o f r e a c -
t i v e i n t e r m e d i a t e s t o i m p o r t a n t b i o l o g i c a l m o l e c u l e s s u c h
a s G S H ; fi n a l l y t h e p r o c e s s l e a d s t o n e c r o s i s a n d l i v e r
d a m a g e i n g e n e r a l . T h e r e f o r e , f r e e r a d i c a l s s c a v e n g e r s
a n d a n t i o x i d a n t s m a y i n t e r f e r e w i t h t h e t o x i c i t y o f C C l 4 .
E v i d e n c e s u g g e s t s t h a t r e s v e r a t r o l p l a y s a r o l e i n t h e
p r e v e n t i o n o f h u m a n p a t h o l o g i c a l p r o c e s s , s u c h a s i n -
fl a m m a t i o n ( R o t o n d o e t a l . , 1 9 9 8 ; J a n g e t a l . , 1 9 9 9 ) ,
a t h e r o s c l e r o s i s ( P a c e - A s c i a k e t a l . , 1 9 9 6 ; F a u c o n n e a u
e t a l . , 1 9 9 7 ) a n d c a r c i n o g e n e s i s ( J a n g e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e
p r o t e c t i v e e f f e c t h a s b e e n a t t r i b u t e d m a i n l y t o i t s a n t i -
o x i d a n t p r o p e r t i e s ( J a n g e t a l . , 1 9 9 9 ; K e r r y a n d A b b e y ,
1 9 9 7 ) , b u t a l s o t o a n a n t i c y c l o o x y g e n a s e a c t i v i t y ( J a n g
Figure 7. Enzymatic activity of alanine aminotrans-
ferase measured in serum derived from control rats,
CCl4 treated rats (CCl4), CCl4 plus resveratrol (RSV)
treated rats (CCl4 + RSV), and rats treated with
trimethylated resveratrol (MeRSV) in addition to CCl4.
Each bar represents the mean value of experiments
a
performed in duplicate assays SEM (n = 6). Signifi-
b
cantly different from control, P < 0.05. Significantly
different from CCl4 group, P < 0.05
p a r t i a l p r o t e c t i o n f r o m n e c r o s i s a n d i n fl a m m a t i o n i s
o b s e r v e d . T h i s h i s t o p a t h o l o g i c a l a n a l y s i s i s i n a g r e e m e n t
w i t h t h e b i o c h e m i c a l o b s e r v a t i o n s , e s p e c i a l l y w i t h
t h e e n z y m e i n d i c a t i v e o f n e c r o s i s s h o w n i n F i g . 7 .
P a n e l s E a n d F r e p r e s e n t c o n t r o l a n i m a l s o f r e s v e r a t r o l
a n d t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l , r e s p e c t i v e l y p l u s m i n e r a l
o i l ( t h e v e h i c l e o f C C l 4 ) ; n o a l t e r a t i o n s w e r e o b s e r v e d i n
t h e s e l i v e r s .
C o p y r i g h t © 2 0 0 7 J o h n W i l e y & S o n s , L t d .
J . A p p l . T o x i c o l . 2 0 0 8 ; 2 8 : 1 4 7 – 1 5 5
D O I : 1 0 . 1 0 0 2 / j a t

R E S V E R A T R O L A N D T R I M E T H Y L A T E D R E S V E R A T R O L P R E V E N T L I V E R D A M A G E 1 5 3
Figure 8. Hematoxylin and eosin staining of liver sections from: (A) control rats (vehicle); (B) CCl4-treated rats; (C)
rats treated with resveratrol, (D) rats administered with CCl4 plus resveratrol; (E) represents a liver section from a
rat receiving trimethylated resveratrol plus CCl4 and (F) represent trimethylated resveratrol alone group. This figure
is available in colour online at www.interscience.wiley.com/journal/jat
e t a l . , 1 9 9 7 ; M a c C a r r o n e e t a l . , 1 9 9 9 ) , a n d t o a m o d u l a t i n g
a c t i v i t y o f l i p i d a n d l i p o p r o t e i n m e t a b o l i s m ( G o l d b e r g
e t a l . , 1 9 9 5 ) . I t h a s a l s o b e e n r e p o r t e d t h a t r e s v e r a t r o l i n -
h i b i t s t h e a c t i v a t i o n o f N F - κB ( T s a i e t a l . , 1 9 9 9 ) .
S t i l v a l a e t a l . ( 2 0 0 1 ) p e r f o r m e d s t u d i e s i n v i t r o t h a t
s h o w e d t h a t t h e h y d r o x y l g r o u p o f r e s v e r a t r o l i n t h e 4 ′
p o s i t i o n i s r e q u i r e d f o r t h e a n t i o x i d a n t a c t i v i t y , b u t i t a c t s
s y n e r g i s t i c a l l y w i t h t h e 3 - a n d 5 - O H g r o u p s . T h e r e f o r e ,
i t w a s d e c i d e d t o t e s t t h e i m p o r t a n c e o f t h e O H g r o u p s
i n a n i n v i v o s y s t e m o f l i v e r i n j u r y w h i c h d e p e n d s
l a r g e l y o n o x i d a t i v e s t r e s s s u c h a s t h e a c u t e i n t o x i c a t i o n
w i t h C C l 4 ( M u r i e l , 1 9 9 7 , 2 0 0 7 ) . I n a c c o r d a n c e , i t w a s
e x p e c t e d t h a t t h e t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l ( w h e r e t h e
O H g r o u p s a r e r e p l a c e d b y m e t h o x y g r o u p s ) w o u l d b e
i n e f f e c t i v e i n p r o t e c t i n g t h e l i v e r f r o m C C l 4 i n d u c e d
o x i d a t i v e s t r e s s a n d d a m a g e , w h i l e r e s v e r a t r o l w o u l d
C o p y r i g h t © 2 0 0 7 J o h n W i l e y & S o n s , L t d .
J . A p p l . T o x i c o l . 2 0 0 8 ; 2 8 : 1 4 7 – 1 5 5
D O I : 1 0 . 1 0 0 2 / j a t

1 5 4 H . R I V E R A E T A L .
F o r n i L G , P a c k e r J E , S l a t e r T F , W i l l s o n R L . 1 9 8 3 . R e a c t i o n o f
t h e t r i c h l o r o m e t h y l a n d h a l o t h a n e - d e r i v e d p e r o x y r a d i c a l s w i t h
u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s : a p u l s e r a d i o l y s i s s t u d y . C h e m . B i o l . I n t e r a c t .
4 5 : 1 7 1 – 1 7 7 .
F r e m o n t L . 2 0 0 0 . B i o l o g i c a l e f f e c t s o f r e s v e r a t r o l . L i f e S c i . 6 6 : 6 6 3 –
6 7 3 .
G l o s s m a n M , N e v i l l e D M . 1 9 7 2 . G l u t a m y l t r a n s f e r a s e i n k i d n e y b r u s h
b o r d e r m e m b r a n e s . F E B S L e t t . 1 9 : 3 4 0 – 3 4 4 .
G o l d b e r g D M , H a h n S E , P a r k e s J G . 1 9 9 5 . B e y o n d a l c o h o l : b e v e r a g e
c o n s u m p t i o n a n d c a r d i o v a s c u l a r m o r t a l i t y . C l i n . C h i m . A c t a 2 3 7 :
1 5 5 – 1 8 7 .
H e y n e k a m p J J , W e b e r W M , H u n s a k e r L A , G o n z a l e z A M , O r l a n d o R A ,
D e c k L M , V a n d e r J a g t D L . 2 0 0 6 . S u b s t i t u t e d t r a n s - s t i l b e n e s , i n c l u d -
i n g a n a l o g u e s o f t h e n a t u r a l p r o d u c t r e s v e r a t r o l , i n h i b i t t h e h u m a n
t u m o r n e c r o s i s f a c t o r a l p h a - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r
n u c l e a r f a c t o r k a p p a B . J . M e d . C h e m . 4 9 : 7 1 8 2 – 7 1 8 9 .
H i s s i n P J , H i l f R . 1 9 7 6 . A fl u o r o m e t r i c m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f
o x i d i z e d a n d r e d u c e d g l u t a t h i o n e i n t i s s u e s . A n a l . B i o c h e m . 7 4 : 2 1 4 –
2 2 6 .
J a n g M , C a i L , U d e a n i G O , S l o w i n g K V , T h o m a s C F , B e e c h e r C W ,
F o n g H H , F a r n s w o r t h N R , K i n g h o r n A D , M e h t a R G , M o o n R C ,
P e z z u t o J M . 1 9 9 7 . C a n c e r c h e m o p r e v e n t i v e a c t i v i t y o f r e s v e r a t r o l , a
n a t u r a l p r o d u c t d e r i v e d f r o m g r a p e s . S c i e n c e 2 7 5 : 2 1 8 – 2 2 0 .
J a n g D S , K a n g B S , R y u S Y , C h a n g I M , M i n K R , K i m Y . 1 9 9 9 . I n h i b i -
t o r y e f f e c t s o f r e s v e r a t r o l a n a l o g s o n u n o p s o n i z e d z y m o s a n - i n d u c e d
o x y g e n r a d i c a l p r o d u c t i o n . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 5 7 : 7 0 5 – 7 1 2 .
K a s d a l l a h - G r i s s a A , M o r n a g u i B , A o u a n i E , H a m m a m i M , G h a r b i N ,
K a m o u n A , E l - F a z a a S . 2 0 0 6 . P r o t e c t i v e e f f e c t o f r e s v e r a t r o l i n r a t s .
A l c o h o l A l c o h o l 4 1 : 2 3 6 – 2 3 9 .
K a w a d a N , S e k i S , I n o u e M , K u r o k i T . 1 9 9 8 . E f f e c t o f a n t i o x i d a n t s ,
r e s v e r a t r o l , q u e r c e t i n , a n d N - a c e t y l c y s t e i n e , o n t h e f u n c t i o n s o f
c u l t u r e d r a t h e p a t i c s t e l l a t e c e l l s a n d K u p f f e r c e l l s . H e p a t o l o g y 2 7 :
1 2 6 5 – 1 2 7 4 .
K e r r y N L , A b b e y M . 1 9 9 7 . R e d w i n e a n d f r a c t i o n a t e d p h e n o l i c
c o m p o u n d s p r e p a r e d f r o m r e d w i n e i n h i b i t l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n
o x i d a t i o n i n v i t r o . A t h e r o s c l e r o s i s 1 3 5 : 9 3 – 1 0 2 .
M a c C a r r o n e M , L o r e n z o n T , G u e r r i e r i P , A g r o A F . 1 9 9 9 . R e s v e r a t r o l
p r e v e n t s a p o p t o s i s i n K 5 6 2 c e l l s b y i n h i b i t i n g l i p o x y g e n a s e a n d
c y c l o o x y g e n a s e a c t i v i t y . E u r . J . B i o c h e m . 2 6 5 : 2 7 – 3 4 .
M i c o B A , P o h l L R . 1 9 8 3 . R e d u c t i v e o x y g e n a t i o n o f c a r b o n t e t r a c h l o -
r i d e : t r i c h l o r o m e t h y l p e r o x y r a d i c a l a s a p o s s i b l e i n t e r m e d i a t e i n t h e
c o n v e r s i o n o f c a r b o n t e t r a c h l o r i d e t o e l e c t r o p h i l i c c h l o r i n e . A r c h .
B i o c h e m . B i o p h y s . 2 2 5 : 5 9 6 – 6 0 9 .
M o s k a u g J Ø , C a r l s e n H , M y h r s t a d M C W , B l o m h o f f R . 2 0 0 5 .
P o l y p h e n o l s a n d g l u t a t h i o n e s y n t h e s i s r e g u l a t i o n . A m . J . C l i n . N u t r .
8 1 : 2 7 7 – 2 8 3 .
p r o b a b l y p r e v e n t b o t h o x i d a t i v e s t r e s s a n d l i v e r d a m a g e .
I n t e r e s t i n g l y , t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l p r o t e c t e d b e t t e r t h e
l i v e r a g a i n s t C C l 4 i n j u r y i n c l u d i n g a b e t t e r p r o t e c t i o n o n
l i p i d p e r o x i d a t i o n . S e v e r a l h y p o t h e s e s m a y e x p l a i n t h e
o b s e r v e d r e s u l t s . T h e m o s t l i k e l y o n e i s r e l a t e d t o t h e
h a l f - l i f e o f r e s v e r a t r o l w h i c h i s r a p i d l y m e t a b o l i z e d t o
i t s s u l p h a t e o r g l u c u r o n a t e c o n j u g a t e s . I n t h i s s e n s e t h e
t r i m e t h y l a t e d O H m a y p r o t e c t t h e d r u g f o r s o m e t i m e
u n t i l i t i s d e m e t h y l a t e d t o r e s v e r a t r o l , a c t i n g a s a p r o d r u g
a n d i n c r e a s i n g t h e h a l f - l i f e o f t h e o r i g i n a l c o m p o u n d
( S a l e e t a l . , 2 0 0 4 ) . O t h e r e x p l a n a t i o n s c a n n o t b e
d i s c a r d e d s i n c e t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l m a y a c t l i k e
r e s v e r a t r o l t h r o u g h a n t i c y c l o o x y g e n a s e a c t i v i t y , b y m o d u -
l a t i n g t h e a c t i v i t y o f l i p i d a n d l i p o p r o t e i n m e t a b o l i s m o r
b y i n h i b i t i n g t h e a c t i v a t i o n o f N F - κB ( J a n g e t a l . , 1 9 9 7 ;
M a c C a r r o n e e t a l . , 1 9 9 9 ; G o l d b e r g e t a l . , 1 9 9 5 ; T s a i
e t a l . , 1 9 9 9 ) . I n f a c t , r e c e n t l y i t h a s b e e n p r o v e d t h a t
t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l a n d o t h e r m e t h o x y - s u b s t i t u t e d
t r a n s - s t i l b e n e s a r e m o r e a c t i v e t h a n r e s v e r a t r o l a s
i n h i b i t o r s o f t h e T N F - α i n d u c e d a c t i v a t i o n o f N F - κB
( H e y n e k a m p e t a l . , 2 0 0 6 ) . A n o t h e r i n t e r e s t i n g e f f e c t o f
t h e c o m p o u n d s i s t h a t t h e y s e e m t o s t i m u l a t e g l u t a t h i o n e
s y n t h e s i s , s i n c e t o t a l g l u t a t h i o n e ( G S H + G S S G ) i n
t h e l i v e r , a s i n b l o o d , a r e e l e v a t e d b y b o t h n o r m a l a n d
t r i m e t h y l a t e d r e s v e r a t r o l . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e s e c o m -
p o u n d s , a s d o o t h e r p o l y p h e n o l s , i n c r e a s e t h e e x p r e s s i o n
o f γ- g l u t a m y l c y s t e i n e s y n t h e t a s e , t h e r a t e l i m i t i n g e n z y m e
i n g l u t a t h i o n e s y n t h e s i s ( M o s k a u g e t a l . , 2 0 0 5 ) .
I n s u m m a r y , b o t h c o m p o u n d s r e s v e r a t r o l a n d t h e
s y n t h e s i z e d t r i m e t h y l a t e d a n a l o g w e r e c a p a b l e o f p r e v e n t -
i n g l i v e r d a m a g e i n d u c e d b y a c u t e i n t o x i c a t i o n o f C C l 4 .
I n t e r e s t i n g l y , t h e s y n t h e s i z e d c o m p o u n d s h o w e d a m o r e
p r o n o u n c e d e f f e c t m a i n l y o n t h e p r e v e n t i o n o f l i p i d
p e r o x i d a t i o n a n d s e r u m e n z y m e a c t i v i t y o f γ- g l u t a m y l
t r a n s p e p t i d a s e . A l i k e l y e x p l a n a t i o n i s t h a t t r i m e t h y l a t e d
r e s v e r a t r o l m a y b e a c t a s a p r o d r u g , t h e r e f o r e i n c r e a s i n g
t h e h a l f - l i f e o f r e s v e r a t r o l .
M u r i e l P . 1 9 9 7 . P e r o x i d a t i o n o f l i p i d s a n d l i v e r d a m a g e . I n O x i d a n t s
H ( e d s ) . T a y l o r & F r a n c i s :
a n d F r e e R a d i c a l s , B a s k i n S I , S a l e m
W a s h i n g t o n ; 2 3 7 – 2 5 7 .
M u r i e l P . 2 0 0 7 . S o m e e x p e r i m e n t a l m o d e l s o f l i v e r d a m a g e . I n
H e p a t o t o x i c i t y : F r o m G e n o m i c s t o I n V i t r o a n d I n V i v o M o d e l s ,
S a h u S ( e d . ) . J o h n W i l e y & S o n s : W e s t S u s s e x U K ( i n p r e s s ) .
O k a w a H , O h m i s h i N , Y a g i K . 1 9 7 9 . A s s a y f o r l i p i d p e r o x i d e s i n
a n i m a l t i s s u e s b y t h e t h i o b a r b i t u r i c a c i d r e a c t i o n . A n a l . B i o c h e m . 9 5 :
3 5 1 – 3 5 8 .
A c k n o w l e d g e m e n t s — T h e a u t h o r s e x p r e s s t h e i r g r a t i t u d e t o B i o l . M a r i o
G . M o r e n o , M r B e n j a m í n S a l i n a s H e r n á n d e z , M r R a m ó n H e r n á n d e z ,
L i c . E n f . R o s a H . F l o r e s a n d Q . F . B . S i l v i a G a l i n d o f o r t h e i r e x c e l l e n t
t e c h n i c a l a s s i s t a n c e . H o r a c i o R i v e r a w a s a f e l l o w o f C o n a c y t .
P a c e - A s c i a k C R , R o u n o v a O , H a h n S E , D i a m a n d i s E P , G o l d b e r g D M .
1 9 9 6 . W i n e s a n d g r a p e j u i c e s a s m o d u l a t o r s o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n
i n h e a l t h y h u m a n s u b j e c t s . C l i n . C h i m . A c t a 2 4 6 : 1 6 3 – 1 8 2 .
R e i t m a n S , F r a n k e l S . 1 9 5 7 . A c o l o r i m e t r i c m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n
o f s e r u m o x a l o a c e t i c a n d g l u t a m i c p y r u v i c t r a n s a m i n a s e s . A m . J .
C l i n . P a t h o l . 2 8 : 5 6 – 6 3 .
R o s e n H R , K e e f f e E B . 2 0 0 0 . E v a l u a t i o n o f a b n o r m a l l i v e r e n z y m e s ,
u s e o f l i v e r t e s t , a n d t h e s e r o l o g y o f v i r a l h e p a t i t i s . I n L i v e r D i s e a s e
D i a g n o s i s a n d M a n a g e m e n t , B a c o n B R , D i B i s c e g l i e A M ( e d s ) .
C h u r c h i l l : N e w Y o r k ; 2 4 – 3 5 .
References
A r a C , K i r i m l i o g l u H , K a r a b u l u t A B , C o b a n S , A y S , H a r p u t l u o g l u M ,
K i r i m l i o g l u V , Y i l m a z S . 2 0 0 5 . P r o t e c t i v e e f f e c t o f r e s v e r a t r o l
a g a i n s t o x i d a t i v e s t r e s s i n c h o l e s t a s i s . J . S u r g . R e s . 1 2 7 : 1 1 2 – 1 1 7 .
B r a d f o r d M M . 1 9 7 6 . A r a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r t h e q u a n t i t a t i o n
o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h e p r i n c i p l e o f p r o t e i n
d y e b i n d i n g . A n a l . B i o c h e m . 7 2 : 2 4 8 – 2 5 4 .
B u r k i t t M , D u n c a n J . 2 0 0 0 . E f f e c t s o f t r a n s - r e s v e r a t r o l o n c o p p e r -
d e p e n d e n t h y d r o x y l - r a d i c a l f o r m a t i o n a n d D N A d a m a g e : e v i d e n c e
f o r h y d r o x y l - r a d i c a l f o r m a t i o n a n d
R o t o n d o S , R a j t a r G , M a n a r i n i S , C e l a r d o A , R o t i l l o D , d e G a e t a n o G ,
E v a n g e l i s t a V , C e r l e t t i C . 1 9 9 8 . E f f e c t o f t r a n s r e s v e r a t r o l , a n a t u r a l
p o l y p h e n o l i c c o m p o u n d , o n h u m a n p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e
f u n c t i o n . B r . J . P h a r m a c o l . 1 2 3 : 1 6 9 1 – 1 6 9 9 .
a n o v e l , g l u t a t h i o n e - s p a r k i n g
m e c h a n i s m o f a c t i o n . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 3 8 1 : 2 5 3 – 2 6 3 .
F a u c o n n e a u B , W a f f o - T e g u o P , H u g u e t F , B a r r i e r L , D e c e n d i t A ,
M e r i l l o n J M . 1 9 9 7 . C o m p a r a t i v e s t u d y o f r a d i c a l s c a v e n g e r a n d a n t i -
o x i d a n t p r o p e r t i e s o f p h e n o l i c c o m p o u n d s f r o m V i t i s v i n i f e r a c e l l
c u l t u r e s u s i n g i n v i t r o t e s t s . L i f e S c i . 6 1 : 2 1 0 3 – 2 1 1 0 .
S a l e S , V e r s c h o y l e R D , B o o c o c k D , J o n e s D J , W i l s h e r N , R u p a r e l i a K C ,
P o t t e r G A , F a r m e r P B , S t e w a r d W P , G e s c h e r A J . 2 0 0 4 . P h a r m a c o -
k i n e t i c s i n m i c e a n d g r o w t h i n h i b i t o r y p r o p e r t i e s o f t h e p u t a t i v e c a n -
c e r c h e m o p r e v e n t i v e a g e n t r e s v e r a t r o l a n d t h e s y n t h e t i c a n a l o g u e
t r a n s 3 , 4 , 5 , 4 ′t e t r a m e t h o x y s t i l b e n e . B r . J . C a n c e r 9 0 : 7 3 6 – 7 4 4 .
C o p y r i g h t © 2 0 0 7 J o h n W i l e y & S o n s , L t d .
J . A p p l . T o x i c o l . 2 0 0 8 ; 2 8 : 1 4 7 – 1 5 5
D O I : 1 0 . 1 0 0 2 / j a t

R E S V E R A T R O L A N D T R I M E T H Y L A T E D R E S V E R A T R O L P R E V E N T L I V E R D A M A G E 1 5 5
S e n e r G , T o k l u H Z , S e h i r l i O , V e l i o g l u - O g u n c A , C e t i n e l S , G e d i k N .
2 0 0 6 a . P r o t e c t i v e e f f e c t s o f r e s v e r a t r o l a g a i n s t a c e t a m i n o p h e n -
i n d u c e d t o x i c i t y i n m i c e . H e p a t o l . R e s . 3 5 : 6 2 – 6 8 .
W a l l e T , H s i e h F , D e l e g g e M H , O a t i s J E J r , W a l l e K . 2 0 0 4 . H i g h
a b s o r p t i o n b u t v e r y l o w b i o a v a i l a b i l i t y o f o r a l r e s v e r a t r o l i n h u m a n s .
D r u g M e t a b . D i s . 3 2 : 1 3 7 7 – 1 3 8 2 .
S e n e r G , T u g t e p e H , Y u k s e l M , C e t i n e l S G e d i k N , Y e g e n B C . 2 0 0 6 b .
R e s v e r a t r o l i m p r o v e s i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n - i n d u c e d o x i d a t i v e r e n a l
i n j u r y i n r a t s . A r c h . M e d . R e s . 3 7 : 8 2 2 – 8 2 9 .
S g a m b a t o A , A r d i t o R , F a r a g l i a B , B o n i n s e g n a A , W o l f F I , C i t t a d i n i A .
2 0 0 1 . R e s v e r a t r o l , a n a t u r a l p h e n o l i c c o m p o u n d , i n h i b i t s c e l l p r o -
l i f e r a t i o n a n d p r e v e n t s o x i d a t i v e D N A d a m a g e . M u t a t . R e s . 4 8 6 :
1 7 1 – 1 8 0 .
W a l l e r a t h T , D e c k e r t G , T e r n e s T , A n d e r s o n H , L i H , W i t t e K ,
F o r s t e r m a n n U . 2 0 0 2 . R e s v e r a t r o l , a p o l y p h e n o l i c p h y t o a l e x i n p r e s e n t
i n r e d w i n e , e n h a n c e s e x p r e s s i o n a n d a c t i v i t y o f e n d o t h e l i a l n i t r i c
o x i d e s y n t h a s e . C i r c u l a t i o n 1 0 6 : 1 6 5 2 – 1 6 5 8 .
W e b e r L W D , B o l l M , S t a m p fl A . 2 0 0 3 . H e p a t o t o x i c i t y a n d m e c h a n i s m
a t o x i c o l o g i c a l
o f a c t i o n o f h a l o a l k a n e s : c a r b o n t e t r a c h l o r i d e a s
m o d e l . C r i t . R e v . T o x i c o l . 3 3 : 1 0 5 – 1 3 6 .
S t i v a l a L A , S a v i o M , C a r a f o l i F , P e r u c c a P , B i a n c h i L , M a g a G , F o r t i L ,
P a g n o n i U M , A l b i n i A , P r o s p e r i E , V a n n i n i V . 2 0 0 1 . S p e c i fi c s t r u c -
t u r a l d e t e r m i n a n t s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e a n t i o x i d a n t a c t i v i t y a n d t h e
c e l l c y c l e e f f e c t s o f r e s v e r a t r o l . J . B i o l . C h e m . 2 7 6 : 2 2 5 8 6 – 2 2 5 9 4 .
T s a i S H , L i n - S h i a u S Y , L i n J K . 1 9 9 9 . S u p p r e s s i o n o f n i t r i c o x i d e
s y n t h a s e a n d t h e d o w n r e g u l a t i o n o f t h e a c t i v a t i o n o f N F k a p p a B i n
m a c r o p h a g e s b y r e s v e r a t r o l . B r . J . P h a r m a c o l . 1 2 6 : 6 7 3 – 6 8 0 .
W u J M , W a n g Z R , H s i c h T C , B r u d e r J L , H u a n g Y Z . 2 0 0 1 . M e c h a n i s m
o f c a r d i o p r o t e c t i o n b y r e s v e r a t r o l a p h e n o l i c a n t i o x i d a n t p r e s e n t i n
r e d w i n e . I n t . J . M o l . M e d . 8 : 3 – 1 7 .
Y o s h i d a T , A d a c h i E , N i g i H , F u j i i S , Y a n a g i M . 1 9 9 9 . C h a n g e s o f
s i n u s o i d a l b a s e m e n t m e m b r a n e c o l l a g e n s i n e a r l y h e p a t i c fi b r o s i s
i n d u c e d w i t h C C l 4 i n c y n o m o l g u s m o n k e y s . P a t h o l o g y 3 1 : 2 9 –
3 5 .
C o p y r i g h t © 2 0 0 7 J o h n W i l e y & S o n s , L t d .
J . A p p l . T o x i c o l . 2 0 0 8 ; 2 8 : 1 4 7 – 1 5 5
D O I : 1 0 . 1 0 0 2 / j a t