Assessment of the in vitro and in vivo toxicity of 3,4- dihydroxyphenylacetaldehyde (DOPAL)

Article abstract of DOI:10.1016/s0003-4509(04)94321-0

This work was carried out in order to evaluate the in vitro and in vivo toxicity of 3,4-dihydroxyphenylacetaldehyde (DOPAL). This aldehyde is formed from dopamine (DA) by monoamine oxidases (MAO) and is mainly oxidised to 3,4-dihydroxyphenylacetic acid by

Full text of DOI:10.1016/s0003-4509(04)94321-0

© Masson, Paris, 2004
Ann Pharm Fr 2004, 62 : 323-331
Communication
Recherche d’une toxicité
du 3,4-dihydroxyphénylacétaldéhyde
(DOPAL) in vitro et in vivo
J.-J. Bonnet, H. Legros, Fr. Janin, N. Dourmap, J. Costentin,
Résumé. Le but de ce travail était d’évaluer la toxicité du
Summary. This work was carried out in order to evaluate the
3,4-dihydroxyphénylacétaldéhyde (DOPAL) in vitro et in vivo. in vitro and in vivo toxicity of 3,4-dihydroxyphenylacetaldehyde
Cet aldéhyde résulte de l’action des monoamine-oxydases
(MAO) sur la dopamine (DA) et il est généralement oxydé en
acide 3,4-dihydroxyphénylacétique (DOPAC) par les aldéhyde
déshydrogénases cérébrales (ALDH), ou éventuellement
(DOPAL). This aldehyde is formed from dopamine (DA) by
monoamine oxidases (MAO) and is mainly oxidised to 3,4-
dihydroxyphenylacetic acid by brain aldehyde dehydrogenases
(ALDH), or eventually reduced to 3,4-dihydroxyphenylethanol
réduit par les aldéhyde/aldose réductases. In vitro, des cellules by aldose/aldehyde reductases. In vitro, catecholaminergic
SH-SY5Y ont été incubées avec de la DA et du disulfirame
(DSF), un inhibiteur irréversible d’ALDH. Le test MTT révèle
SH-SY5Y cells were incubated with DA and disulfiram (DSF),
an irreversible inhibitor of ALDH. As evidenced by MTT
assays, a 24-h treatment with 10–4 M DA and/or 10–6 M DSF
followed by a 24-h incubation in a drug-free medium eviden-
ced that the toxicity of each of these drugs was potentia-
ted by the second drug. HPLC measurements demonstrated
that this drug association induced an early DOPAL production
that could result in a delayed cell toxicity. For in vivo studies,
qu’un traitement de 24 h avec la DA 10– 4 M et/ou le DSF10– 6
M
suivi d’une incubation de 24 h dans un milieu sans réactif se
traduit par une potentialisation de l’effet toxique de chacun
des réactifs par le second. Des mesures HPLC démontent
que cette association induit une formation précoce de
DOPAL qui pourrait se traduire par une toxicité cellulaire
différée de quelques dizaines d’heures. Pour les essais in male Sprague-Dawley rats were treated with L-DOPA-bensera-
vivo, des rats mâles Sprague-Dawley ont été traités par la
L-DOPA/bensérazide, qui accroît la production de DOPAL par
les MAO, et le DSF. Une administration aigue de DSF
(100 mg/kg i.p.) et de L-DOPA/bensérazide (100 mg/kg
+ 25 mg/kg, 24 h plus tard) augmente significativement le
taux de DOPAL striatal. Cependant, un traitement de
30 jours par le DSF (100 mg/kg i.p., une fois tous les deux
jours) et la L-DOPA/bensérazide (100 mg/kg + 25 mg/kg,
deux fois par jour) n’affecte pas deux index de l’intégrité des
terminaisons striatales des neurones dopaminergiques (le
contenu striatal de DA et la liaison au transporteur vésiculaire
présent dans ces terminaisons). Ces résultats ne confortent
zide, which increases the production of DOPAL by MAO, and
DSF. An acute injection of DSF (100mg/kg i.p.) and L-DOPA/
benserazide (100mg/kg+25mg/kg, 24h later) significantly
increased the DOPAL striatal level. However, a 30-day treat-
ment with DSF (100mg/kg i.p., once every two days) and L-
DOPA/benserazide (100mg/kg+25mg/kg, twice a day) did not
affect both indexes used to assess the integrity of the nigro-
striatal dopaminergic terminals (i.e. the striatal content in DA
and the binding to the vesicular monoamine transporter on
striatal membranes). These results do not support the hypo-
thesis of a DOPAL toxicity and argue against the toxicity of
L-DOPA therapy.
Unité de Neuropsychopharmacologie Expérimentale, FRE2735 CNRS, IFRMP N° 23, 22 Boulevard Gambetta, F76183 Rouen Cedex.
Présentation devant l’Académie nationale de pharmacie, séance du 17 mars 2004 délocalisée à Rouen.
Tirés à part : J.-J. Bonnet, à l’adresse ci-dessus.
E-mail : neuro.psyphar@univ-rouen.fr
323

J.-J. Bonnet et Coll.
pas l’hypothèse d’une toxicité du DOPAL et vont à l’encontre
d’une toxicité de la L-DOPA.
Key-words: 3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyde, Brain alde-
hyde dehydrogenases, Toxicity, SH-SY5Y cells, Rats.
Assessment of the in vitro and in vivo toxicity of 3,4-dihy-
droxyphenylacetaldehyde (DOPAL). J.-J. Bonnet, H. Legros,
Fr. Janin, N. Dourmap, J. Costentin. Ann Pharm Fr 2004, 62 :
323-331
Mots-clés : 3,4-dihydroxyphénylacétaldéhyde, Aldéhyde
déshydrogénases cérébrales, Toxicité, Cellules SH-SY5Y,
Rats.
vérifié qu’elles étaient capables d’accumuler la
DA contenue dans le milieu d’incubation, nous
avons favorisé l’accumulation du DOPAL dans
ces cellules en réduisant l’activité ALDH avec le
disulfirame (DSF), un inhibiteur irréversible,
efficace in vitro et in vivo [10]. In vivo, des rats ont
été soumis à un traitement de 30 jours associant
L-DOPA/bensérazide à un blocage de certaines
ALDH cérébrales par le DSF. Cette association
reproduit la situation dans laquelle le malade
Introduction
Quelques études in vitro suggèrent que le 3,4-
dihydroxyphénylacétaldéhyde (DOPAL) pourrait
être toxique pour les neurones dopaminergiques
[1-4]. Cet aldéhyde résulte de l’action des
monoamines oxydases (MAO) sur la dopamine
(DA) ; au niveau cérébral, il est rapidement oxydé
en acide dihydroxyphénylacétique (DOPAC) par
des aldéhyde déshydrogénases (ALDH), mais il
peut aussi, pour une faible part, être réduit en traité par la L-DOPA a une activité ALDH dépri-
3,4-dihydroxyphényléthanol (DOPET) par des
aldose/aldéhyde réductases [2]. Le DOPAL pour-
rait être une neurotoxine endogène, puisque sa
forte réactivité peut affecter l’intégrité cellulaire :
il peut alkyler les thiols et fonctions amines des
protéines et/ou acides nucléiques, et se condenser
avec la DA elle-même pour former des dérivés
dont certains sont toxiques [5]. De plus, le
DOPAL peut former des radicaux OH– à partir du
H2O2 produit par les MAO [6] et il peut accroître
la toxicité résultant d’une inhibition du métabo-
lisme cellulaire de base [2].
Les neurones dopaminergiques seraient une
cible privilégiée de cette toxicité puisque, dans le
striatum de Rat (aire cérébrale correspondant au
Caudé et au Putamen chez l’Homme), le métabo-
lisme de la DA résulte, quasi exclusivement, de
l’activité MAO A présente dans leurs terminai-
sons, y compris lorsque celles-ci se raréfient et à
la suite d’un traitement par la L-DOPA, condi-
tions qui sont celles que l’on rencontre chez le
Parkinsonien [7, 8].
mée ; ainsi, un déficit génétique rend inopérante
l’ALDH2 cérébrale chez environ 50 % des asiati-
ques [11], et une réduction de l’activité ALDH
cérébrale est observée chez les patients traités, par
exemple, par le DSF utilisé comme agent anti-
dipsotropique (Antabuse®, Espéral®), par des anti-
cancéreux de la famille des oxazaphosphorines, ou
différents sulfamides hypoglycémiants. L’inté-
grité des terminaisons dopaminergiques striatales
a été estimée ex vivo, en mesurant le contenu en
DA et la liaison de dihydrotétrabénazine tritiée
(TBZOH) sur le transporteur présent dans la
membrane des vésicules synaptiques contenues
dans ces terminaisons. Ces deux mesures sont
connues pour être de bons index d’une destruc-
tion des terminaisons dopaminergiques striatales
[12, 13].
Matériels et méthodes
Les cellules SH-SY5Y (numéro ECACC 9403304),
fournies par A. Koulakoff du Collège de France,
ont été cultivées dans un milieu de Eagle modifié
par Dulbecco contenant de la L-glutamine et
additionné de 10 % de sérum de veau fœtal inac-
tivé par la chaleur, 100 μg/ml de streptomycine
Le but de ce travail était donc d’évaluer la toxi-
cité du DOPAL in vitro et in vivo. In vitro, nous
avons utilisé une lignée de neuroblastome
humain présentant des propriétés des neurones
catécholaminergiques, les cellules SH-SY5Y, dont
la sensibilité aux toxines affectant les neurones
dopaminergiques a été décrite [9]. Après avoir et 100 UI/ml de pénicilline. Les cultures étaient
324

Toxicité du DOPAL in vitro et in vivo
maintenues à 37 °C dans une atmosphère
humide contenant 5 % de CO2.
HPLC appliquée à la détermination
du taux de DA ex vivo
Pour ces études, les striatas des rats ont été pré-
levés rapidement selon la méthode de Glowinski
et Iversen [17], puis homogénéisés par sonication
dans 5 volumes (pds/vol) d’une solution glacée
de 0,1 % de cystéine dans l’acide perchlorique
0,1 N. Les homogénats ont été centrifugés
(10 000 g × 10 mn) et le surnageant filtré avant
d’être congelé à – 80 °C jusqu’au moment du
dosage. Le protocole de dosage décrit plus haut a
été repris avec une phase mobile contenant
KH2PO4 88 mM, méthanol 1 %, EDTA 0,5 mM et
de l’acide heptane sulfonique 6,4 mM.
Essais de toxicité in vitro
Ces essais ont été menés sur des cellules en culture
depuis deux jours. Les SH-SY5Y ont été incubées
24 h à 37 °C (en présence de 5 % CO2) dans du
milieu de culture frais contenant la DA ou le DSF
dissout dans le même milieu. La viabilité cellu-
laire a été évaluée par le test du 3-[4,5-diméthyl-
thiazol-2-yl]-2,5 diphényltétrazolium (MTT) [14],
soit immédiatement, soit après 24 h de remise en
culture dans du milieu neuf. Les données sont
exprimées en absorbance à 570 nm diminuée du
bruit de fond à 630 nm.
Préparations du DOPAL et du DOPET
Ces produits ont été synthétisés pour servir de
référence en HPLC. Le DOPAL a été préparé
extemporanément, par désamination oxydative
de la DA par la MAO, selon la méthode de Colzi
et al. [18] modifiée [12]. Le spectre de masse du
produit obtenu a confirmé la nature du DOPAL.
Les concentrations de DOPAL ont été calculées
selon Colzi et al. [18]. Le DOPET a été synthétisé
et purifié selon la méthode de Baraldi et al. [19].
Techniques d’HPLC appliquées
aux cultures cellulaires
Les dosages ont été réalisés sur des cultures à
80 % de confluence dans des boites de 10 cm de
diamètre. Les cellules étaient incubées à 37 °C
dans 10 ml de milieu de culture contenant la DA
et/ou le DSF. À la fin de cette incubation, le
milieu a été aspiré, filtré (0,45 μm) et injecté
(20 μl) dans le système HPLC. Les cellules ont
été rapidement rincées deux fois avec 15 ml de
milieu PBS stérile [NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM,
KH2PO4 1,4 mM, Na2HPO4 8,1 mM, MgCl2
1 mM, CaCl2 0,1 mM (pH 7,4)], puis décollées et
centrifugées (3 000 rpm × 5 mn). Après élimina-
tion du surnageant, les cellules ont été remises en
suspension dans une solution de 0,1 % de cys-
téine dans l’acide perchlorique 0,1 N. La suspen-
sion était lysée par sonication et centrifugée
(10 000 g × 10 mn) afin de recueillir le surna-
geant qui était filtré puis injecté dans le système
HPLC. Tous les échantillons étaient maintenus
à 4 °C avant d’être analysés rapidement. La
détermination des concentrations de DA et de
ses métabolites reprend un protocole déjà décrit
[15], à l’exception de la composition de la phase
mobile qui était constituée dans la présente
étude de KH2PO4 88 mM, méthanol 1 %, EDTA
0,5 mM et de pic B7 2,1 % (Waters).
Liaison de TBZOH
Les striatas de rats ont été homogénéisés dans un
homogénéisateur verre Téflon (Potter-Elvehjem,
clairance 80-130 μm) contenant 10 volumes d’un
milieu glacé contenant du saccharose 0,3 M et de
l’HEPES 20 mM (pH 8 avec NaOH). L’homogénat
était ensuite soniqué pour donner une prépara-
tion membranaire qui a été congelée à – 80 °C
jusqu’au moment de son utilisation. Le protocole
de liaison reprend celui qui est décrit par ailleurs
[15].
Animaux. Des rats mâles Sprague Dawley de
200-250 g ont été utilisés. Les conditions de stabu-
lation et de traitement étaient en accord avec la
directive 86/609/EEC du Conseil de la Commu-
nauté européenne.
Activité ALDH
La concentration de protéine a été déterminée Les striatas et les cortex cérébraux ont été homo-
par la méthode de Lowry et al. [16]. Dans ce cas, généisés dans un homogénéisateur verre Téflon
la solution de 0,1 % de cystéine dans l’acide per- contenant 10 volumes (pds/vol) d’un milieu
chlorique 0,1 N était remplacée par un même glacé contenant du saccharose 0,25 M, EDTA
volume de NaOH 0,1 N.
0,5 mM, Tris base 2 mM et Tris chlorhydrate
325

J.-J. Bonnet et Coll.
Tableau I. — Effets de l’association de la dopamine et du di-
sulfirame sur la viabilité des cellules SH-SY5Y.
8 mM (pH 7,4). L’homogénat était ensuite centri-
fugé (13 000 g × 15 mn) et le culot remis en sus-
pension dans le même milieu contenant du
désoxycholate de sodium 0,25 %, immédiate-
ment avant l’essai. L’activité ALDH a été déter-
minée dans un milieu pyrophosphate de sodium
10 mM (pH 9.6) contenant NAD+ 1 mM, pyra-
zole 1 mM (pour éviter la réduction du NAD+ par
les alcool déshydrogénases), roténone 2 μM
(pour prévenir l’oxydation du NADH, H+), et la
préparation tissulaire. Après une incubation de
30 mn à 25 °C, la réaction est lancée par addition
du substrat, le proprionaldéhyde (concentration
finale 50 μM). L’activité ALDH est mesurée par
fluorimétrie grâce à la formation de NADH, H
+ (spectrofluorimètre SFM-23 Kontron ; excita-
tion 340 nm, émission 450 nm).
Deux jours après répartition dans les puits, les cellules sont
débarrassées du milieu de culture qui est remplacé par 1 ml
de milieu de culture neuf contenant la DA 10– 4 M ou/et le
DSF 10– 6 M. Elles sont incubées 24 h à 37 C en présence de
°
5 % CO2 et des réactifs. Leur viabilité est appréciée soit à l’is-
sue de cette incubation, soit après 24 h de remise en culture
dans du milieu neuf (test MTT après deux rinçages avec du
milieu PBS). Les résultats sont exprimés en absorbance
(DO570 nm- DO630 nm) et correspondent à la moyenne S.E.M.
de 3 à 6 essais réalisés en quatre exemplaires. L’inhibition de
l’ALDH par le DSF ne modifie pas les résultats du test MTT.
Effect of a combined treatment with DA and DSF on SH-SY5Y viability.
Two days after cell plating, the culture medium was replaced by 1 ml
of fresh culture medium containing DA 10–4 M and/or DSF 10–6 M,
°
and cells were incubated at 37 C (5% CO2) during 24 h. Their via-
bility was assessed either at the end of this incubation or after culture
in a drug-free culture medium for 24 h (MTT test after two rinses
with PBS). Results are expressed as absorbances (OD 570 nm-OD 630 nm
)
and correspond to means S.E.M of three-six experiments. The only
inhibition of ALDH by DSF did not change results of the MTT test.
Absorbance à l’issue
d’une incubation
de 24 h
Absorbance
après 24 h de remise
en culture
Milieu
d’incubation
Résultats
contrôle
287 16
199 13
609 42
427 36
Dopamine
10– 4
M
Recherche d’une toxicité du DOPAL in vitro
La toxicité de la DA ou du DSF pour les cellules
SH-SY5Y croît avec la durée de l’incubation : la
concentration létale 50 % (CL50) de la DA qui est
supérieure à 1 mM après 1 h d’incubation est de
l’ordre de 70 μM après 24 h. La toxicité du DSF
est plus forte : sa CL50 passe de 80 à 1 μM dans
ces conditions.
Ces éléments connus, nous avons cherché des
conditions expérimentales susceptibles d’engen-
drer une potentialisation des effets toxiques de
chacun des deux réactifs. Une incubation des cel-
lules durant 24 h en présence de DSF 10– 6 M ou
de DA 10– 4 M baisse leur vitalité de l’ordre de 20
à 30 % (tableau I) ; la présence conjointe des deux
réactifs ne se traduit pas par une potentialisation
significative ; cependant, lorsque les cellules sont
remises en culture à 37 °C pendant 24 h dans un
milieu de culture dépourvu de réactifs, les effets
toxiques de la DA et du DSF appliqués isolement
sont significativement potentialisés par le second
réactif (tableau I). Les mêmes essais réalisés avec
le DSF 3.10– 7 M ne produisent pas de potentiali-
sation significative.
Disulfirame
10– 6
232 14
124 141
475 38
231 222
M
Dopamine
+ disulfirame
1 pas d’interaction significative entre les traitements DA et
DSF (F (1,20) = 3,04 ; p = 0,10 ; ANOVA à deux facteurs).
2 interaction significative entre les traitements DA et DSF
(F (1,20) = 4,678 ; p < 0,05) ; un test post-hoc de Newman-
Keuls indique que les effets significatifs de la DA (P < 0,01) et
du DSF (P < 0,05) seuls sont significativement potentialisés
par la présence du second réactif (P < 0,001 dans chacun des
cas).
1 no significant interaction between treatments (F (1.20) = 3.04 ;
p = 0.10 ; two-way ANOVA).
2 significant interaction between treatments (F (1.20) = 4.678,
p < 0.05) ; a Newman-Keuls post-hoc test indicates that the signifi-
cant effects of DA (p < 0.01) and DSF alone (p < 0.05) were poten-
tiated by the presence of the second drug (p < 0.001 in both cases).
après une incubation des SH-SY5Y dans du
milieu de culture seul ou le DSF 10– 6 M. Le
DOPAL, le DOPET et le DOPAC apparaissent à la
suite d’une incubation de 3 h en présence de DA
10– 4 M (fig. 1). Dans ces conditions, une inhibi-
tion des ALDH par le DSF induit une augmenta-
tion significative (P < 0,01) du rapport (DOPAL
+ DOPET)/DOPAC. Par contre, après 15 h d’incu-
Une étude d’HPLC réalisée afin de savoir si une
augmentation de la production de DOPAL pou-
vait expliquer cette potentialisation, montre que bation, la concentration de DA et la production
la DA et ses métabolites ne sont pas détectables de DOPAL sont réduites de 85-90 % (fig. 1).
326

Toxicité du DOPAL in vitro et in vivo
Incubations :
300
225
150
75
16
DA 10-4 M / 3 h d’incubation
DA / 15 h d’incubation
DA 10-4 M + DSF 10-6 M / 3 h
DA + DSF / 15 h
12
8
4
0
0
Dopamine
DOPAC
DOPAL
DOPET
Figure 1. Effet d’une incubation des cellules SH-SY5Y en présence de dopamine 10– 4 M et/ou disulfirame 10– 6 M sur leur
production de métabolites de la dopamine.
Les cellules cultivées dans des boîtes de 10 cm de diamètre ont été incubées à 37 °C pendant 3 h ou 15 h dans 10 ml de milieu
de culture contenant la DA 10– 4 M et parfois le DSF 10– 6 M. Les valeurs correspondent à la quantité totale de DA et métabolites
contenue dans les boîtes en fin d’incubation. Les données présentées sont des moyennes S.E.M. de trois à six essais.
Effect of a combined treatment with 10–4M DA and 10–6 M DSF on the formation of DA metabolites by SH-SY5Y cells. Cell cultures (in
10cm dishes) were treated at 37°C for 3h or 15h in 10ml of culture medium containing 10–4M DA and 10–4M DSF when necessary. Values
correspond to the total amounts of DA and metabolites contained in dishes at the end of the incubation. Data presented are means S.E.M.
of three-six experiments.
Préliminaire à l’étude in vivo
avant le sacrifice) augmente sensiblement les
taux de DA et de DOPAC ; le DOPET devient
mesurable dans ces conditions, mais la concen-
tration de DOPAL n’est pas affectée. Un traite-
ment combiné par les deux réactifs produit quant
à lui une augmentation significative de la concen-
tration de DOPAL et de DOPET (fig. 2). La produc-
tion de DOPAL augmente donc fortement à la
suite d’un traitement par la L-DOPA/bensérazide,
et l’augmentation de sa fraction libre, bien que
difficile à obtenir, est accompagnée par un
accroissement du taux de DOPET.
Nous avons d’abord évalué la capacité du DSF à
bloquer l’activité ALDH in vivo. L’administration
intrapéritonéale (i.p.) de DSF 100 mg/kg provo-
que une inhibition biphasique de l’activité ALDH
mesurée ex vivo (fig. 2) ; cette inhibition culmine
12 heures environ après l’injection et décroît
ensuite lentement pour ne plus différer significa-
tivement de l’activité contrôle au troisième jour
(fig. 2). Une dose de DSF supérieure (150 mg/kg)
produisait des manifestations de toxicité à cours
terme.
Nous avons ensuite mesuré le taux de DA et
de ses métabolites dans le striatum de rat à l’issue
d’un traitement aigu visant à augmenter la pro-
duction de DOPAL dans le SNC (tableau II). Le
traitement par le DSF seul (100 mg/kg, i.p., 24 h
avant le sacrifice) ne modifie pas la concentration
de ces composés relativement à un traitement par
le solvant [solution aqueuse de carboxyméthylcel-
lulose à 1 %, (CMC1 %)]. Par contre, une injection
Recherche d’une toxicité du DOPAL in vivo
Cette recherche a été effectuée 10 jours après la
fin d’un traitement au cours duquel les rats ont
reçu deux injections quotidiennes de L-DOPA/
bensérazide (100 + 25 mg/kg) pendant 30 jours
ou/et une injection de DSF 100 mg/kg les
deux premiers jours puis une injection tous les
deux jours jusqu’au trentième jour. Des injec-
tions de solvant (CMC1 %) ont été pratiquées au
de L-DOPA/bensérazide (100 + 25 mg/kg, i.p., 1 h même rythme chez les contrôles.
327

J.-J. Bonnet et Coll.
Discussion
100
La toxicité de la DA pour les cellules SH-SY5Y se
manifeste pour des concentrations relativement
élevées. Les résultats obtenus ici à l’issue d’une
incubation de 24 heures sont cohérents avec
ceux de Lai et Yu [20] ; ce type cellulaire est
cependant assez sensible à la toxicité de la DA
puisque sa CL50 sur d’autres lignées cellulaires est
plus élevée (de l’ordre de 0,2 – 0,5 mM) dans les
mêmes conditions expérimentales [9, 21, 22].
La DA exerce une toxicité au travers de cibles
mal définies ; ses récepteurs ne semblent pas
impliqués [23, 24] mais sa capacité à entrer dans
les cellules serait un facteur aggravant [25-27].
Par contre, son métabolisme, dans ou hors des
neurones, génère un grand nombre de composés
toxiques ; radicaux oxygénés (OH–, H202), dérivés
(6-OHDA, DOPAL) et produits de condensation
(tétrahydropapavérolines, quinones) [1, 4, 5].
La toxicité du DSF provient de sa capacité, ou
de celle de ses dérivés, à se lier de manière cova-
lente aux groupements -SH des cystéines, inacti-
vant ainsi une diversité considérable de protéines,
y compris certaines de celles qui interviennent
80
*
*
*
60
*
40
20
0
6 12
24
48
72 heures
Figure 2. Cinétique de l’inhibition de l’activité ALDH céré-
brale de forte affinité à la suite d’une injection de disulfirame
chez le rat.
Les rats ont reçu une injection i.p. de DSF (100 mg/kg) et
ont été sacrifiés 6, 12, 24, 48 ou 72 h plus tard. L’activité
ALDH a été évaluée sur des préparations obtenues à partir
des striatas et des cortex cérébraux. L’histogramme de réfé-
rence correspond à l’activité ALDH des contrôles qui s’élevait
à 0,177 0,024 nmoles de NADH /min/mg de protéine. Les
données sont les moyennes de trois ou quatre essais réalisés
en triples exemplaires. Les résultats ont été comparés par
analyse de variance suivie d’un test de Tukey post-hoc :
** p < 0,001, et * p < 0,01 comparé aux contrôles.
Effect of a DSF treatment on the brain low-Km ALDH activity in
rats.
Rats were treated i.p. with DSF 100mg/kg and they were sacrificed
6, 12, 24, 48 or 72h later. ALDH activity was studied on prepara-
tions obtained from striatum and cerebral cortex. The control histo-
gram corresponds to 0.177 0.024 nmoles of NADH/min/mg of
protein. Data are means SEM of 3-4 experiments performed in
triplicate. Results were compared using a one-way ANOVA followed dans la détoxication des produits du métabolisme
by a post-hoc Tukey’s test: ** p<0.001; * p<0.01 when compared to
controls.
de la DA [12, 28]. Cette propriété est aussi à l’ori-
gine de son activité sur certaines des ALDH céré-
brales.
Pour des cellules SH-SY5Y incubées en pré-
Aucune variation de la liaison de TBZOH tri-
sence de DA, le blocage d’une partie de l’activité
tiée au transporteur vésiculaire n’est observée à
ALDH par le DSF produit une augmentation des
la suite des différents traitements. La liaison aux
concentrations de DOPAL et de DOPET (fig. 1).
préparations de membranes striatales obtenues
à partir des rats traités par la L-DOPA/benséra-
Ceci est valable pour autant que l’incubation soit
relativement brève, puisque après 15 h d’incuba-
zide, le DSF ou les deux agents combinés repré-
tion, le taux de DA a fortement chuté, vraisem-
sente 106 6 %, 100 8 % et 101 9 % de la
blablement à la suite de son auto-oxydation. On
liaison mesurée à partir des animaux contrôles.
peut admettre que la présence conjointe de DA
Une analyse de variance à deux facteurs ne
et de DSF augmente précocement la production
révèle aucune interaction entre les traitements
et l’accumulation de DOPAL, ce qui entraînera,
(F (1,26) = 0,137 ; P > 0,05). Des résultats du
plusieurs dizaines d’heures plus tard, une mort
même ordre sont obtenus pour la DA striatale :
cellulaire. Différentes interactions entre les deux
sa concentration représente 101 7 %, 95 6 %
et 105 12 % dans les lots L-DOPA/bensérazide,
DSF et L-DOPA/bensérazide + DSF relativement
à celle qui est mesurée chez les animaux contrô-
les. L’analyse de variance ne décèle aucune inte-
raction entre les traitements (F (1,26) = 0,203 ;
P > 0,05).
réactifs, ou leurs dérivés, peuvent expliquer la
potentialisation de la mort cellulaire qu’ils provo-
quent conjointement. Ainsi, le DSF peut réduire,
directement ou non, le stock de glutathion [12]
qui participe grandement à la capacité des cellules
à résister au stress oxydatif résultant de l’oxyda-
tion de la DA [23]. Par ailleurs, la réduction de la
328

Toxicité du DOPAL in vitro et in vivo
Tableau II. — Effets d’un traitement aigu par le disulfirame ou/et la L-DOPA/bensérazide sur le contenu striatal en dopamine
et ses métabolites chez le rat.
Les animaux ont été traités par le DSF (100 mg/kg, i.p.) ou le solvant (CMC 1 %), et/ou, 24 heures plus tard, par L-DOPA/
bensérazide (100 + 25 mg/kg, i.p.) ou le même solvant une heure avant d’être sacrifiés. La concentration striatale en DA, DO-
PAC, DOPAL et DOPET est mesurée immédiatement par H.P.L.C. Les données correspondent à des moyennes S.E.M. de 3 à
6 rats par lot.
Effect of an acute treatment with DSF and/or L-DOPA-benserazide on rat striatal content of DA and derivatives.
Rats were treated with DSF (100 mg/kg, i.p.) or vehicle. (1% CMC in water), and/or, 24 h later, by L-DOPA-benserazide (100 + 25 mg/kg,
i.p.) or vehicle (1% CMC) 1 h before sacrifice. Striatal levels of DA, DOPAC, DOPAL and DOPET were immediately measured by HPLC. Data
are means SEM of 3-6 rats per group.
concentration striatale (ng/mg de protéine) de
Traitement
dopamine
DOPAC
DOPAL
DOPET
Contrôle
94
5
11,8 1,4
11,1 0,8
216 141
0,54 0,09
0,81 0,12
0,71 0,08
n.d.
n.d.
Disulfirame 100 mg/kg
97 2,5
L-DOPA/bensérazide
(100 + 25 mg/kg)
307 221
0,25 0,06
L-DOPA/bensérazide
+ disulfirame
322 41
244 39
1,89 0,202
1,78 0,383
1 Le traitement par L-DOPA/bensérazide induit une augmentation significative du taux de DA (P < 0,001) et de DOPAC
(P < 0,001) (après traitement ou non par le DSF : ANOVA à deux facteurs).
2 interaction significative entre les traitements DSF et L-DOPA/bensérazide (F (1,16) = 9,43 p < 0,01 ; ANOVA à deux fac-
teurs) ; un test post-hoc de Tukey indique que les effets non significatifs des traitements L-DOPA/bensérazide (P = 0,43) et
DSF seuls (P = 0,28) sur le taux de DOPAL sont significativement potentialisés par le second traitement (P < 0,001 dans cha-
cun des cas).
3 significativement différent du lot L-DOPA/bensérazide (P < 0,01). n.d. non détecté.
1 The treatment by L-DOPA/benserazide significantly increased DA (P < 0.001) and DOPAC contents (P < 0.001) (two-way ANOVA).
2 significant interaction between DSF and L-DOPA/benserazide treatments (F (1.16) = 9.43 p < 0.01; two-way ANOVA); a Tukey post-hoc
test indicates that the non significant effects of L-DOPA/benserazide (P = 0.43) and DSF treatments (P = 0.28) on the DOPAL level were
potentiated by the presence of the second drug (p < 0.001 in both cases).
3significantly different from L-DOPA/benserazide (P < 0.01). n.d. not detected.
fonction mitochondriale par le DSF pourrait être DSF. Si les ALDH cérébrales humaines ont un
potentialisée par le DOPAL [4-12] et la DA.
Il est difficile de savoir quelles sont les ALDH
cérébrales qui oxydent effectivement le DOPAL.
En fonction de leur spécificité, ce pourrait être les
ALDH 1, 2 et 3 [29] mais seule l’ALDH2 serait
comportement similaire, il est peu probable
qu’un déficit génétique ou un traitement phar-
macologique puisse bloquer efficacement l’oxy-
dation du DOPAL.
In vivo, un traitement aigu par L-DOPA/bensé-
présente dans le cerveau humain [30]. Cette razide augmente le taux de DA et de DOPAC sans
ALDH est principalement mitochondriale, aussi affecter la celui du DOPAL (tableau II). Ce résul-
bien chez le rat que chez l’homme [31], et elle tat, comme l’absence d’effet du DSF sur le taux
constitue vraisemblablement une partie de l’acti- de DOPAL et DOPAC, va dans le sens d’une non
vité ALDH centrale de forte affinité pour le saturation de l’activité ALDH cérébrale dans ces
DOPAL et sensible au DSF [10, 32]. Néanmoins, conditions. Cela veut dire aussi que différents
un blocage de cette activité de l’ordre de 50 % processus réduisent la concentration de DOPAL
n’induit pas de réduction de la concentration de produit par les MAO pour des concentrations
DOPAC, même s’il provoque une augmentation physiologiques de DA. Le premier de ceux-ci
significative des taux de DOPAL et DOPET pourrait être l’oxydation en DOPAC, et le
(tableau II). Il faut donc admettre que l’oxydation deuxième, la formation de DOPET ; celui-ci
du DOPAL pourrait ne requérir qu’une petite devient détectable chez les animaux traités par
fraction de l’activité ALDH sensible au DSF et/ou L-DOPA/bensérazide et sa concentration croît à
mettre en jeu une forme d’ALDH insensible au la suite d’un traitement combiné avec le DSF
329

J.-J. Bonnet et Coll.
2. Lamensdorf I, Eisenhofer G, Harvey-White J et al. 3,4-
Dihydroxyphenylacetaldehyde potentiates the toxic
effects of metabolic stress in PC12 cells. Brain Res 2000;
868: 191-201.
(tableau II). Les aldéhyde/aldose réductases rédui-
raient donc le DOPAL quand sa concentration
augmente ; de fait, les essais in vitro montrent que
le DOPET augmente quand l’oxydation du DOPAL
est réduite, et que la production de DOPET semble
maximum en début d’incubation (fig. 1), quand la
production de DOPAL est la plus forte (voir aussi
[2]). Cette production de DOPET est importante
puisqu’il pourrait être antioxydant [33]. Le troi-
sième processus pourrait être la sortie du DOPAL
hors des neurones dopaminergiques. La capacité
du DOPET à diffuser rapidement au travers des
membranes [33], sa similitude structurale avec le
DOPAL et leur commune absence de radical
polaire, font qu’il est vraisemblable que DOPAL
et DOPET puissent rapidement diffuser hors des
neurones dopaminergiques. De plus, le DOPAL
peut également sortir de ces neurones par l’inter-
médiaire du transporteur plasmique de la DA [1].
La maladie de Parkinson qui serait associée à un
stress oxydatif et une dysfonction mitochondriale
[34, 35] pourrait magnifier la toxicité du DOPAL,
d’autant plus que le traitement par la L-DOPA
intensifie sa production par des neurones survi-
vants plus actifs [36]. Nos résultats vont à l’encon-
tre de cette hypothèse, et ils sont en cela cohérents
avec l’ensemble des travaux précédents [37], cer-
tains d’entre eux suggérant même que la L-DOPA
pourrait avoir un rôle trophique [13, 38].
En conclusion, si les résultats obtenus in vitro
ne permettent pas d’écarter une relation entre
une production précoce de DOPAL par les SH-
SY5Y et une toxicité différée, il semble que, in
vivo, différents mécanismes soient capables de
réduire la concentration du DOPAL formé ; dans
ces conditions, la formation accrue et répétée de
DOPAL ne semble pas toxique pour les neurones
dopaminergiques. Il est possible, comme pour la
L-DOPA, que des facteurs neurotrophiques
contrecarrent une possible toxicité du DOPAL
[39]. Ces données montrent les limites des modèles
in vitro et soulignent la pertinence de modèles
plus intégrés.
3. Lamensdorf I, Eisenhofer G, Harvey-White J et al. Meta-
bolic stress in PC12 cells induces the formation of the
endogenous dopaminergic neurotoxin, 3,4-dihydroxy-
phenylacetaldehyde. J Neurosci Res 2000; 60: 552-8.
4. Kristal BS, Conway AD, Brown AM et al. Selective dopa-
minergic vulnerability: 3,4-dihydroxyphenylacetalde-
hyde targets mitochondria. Free Radic Biol Med 2001; 30:
924-31.
5. Storch A, Ott S, Hwang Y-I et al. Selective dopaminergic
neurotoxicity of isoquinoline derivatives related to Par-
kinson’s disease: studies using heterologous expression
systems of the dopamine transporter. Biochem Pharmacol
2002; 63: 909-20.
6. Li SW, Lin TS, Minteer S, Burke WJ. 3,4-Dihydroxyphe-
nylacetaldehyde and hydrogen peroxide generate a
hydroxyl radical : possible role in Parkinson’s disease
pathogenesis. Mol Brain Res 2001; 93: 1-7.
7. Wachtel SR, Abercrombie ED. L-3,4-dihydroxyphenyla-
lanine-induced dopamine release in the striatum of intact
and 6-hydroxydopamine treated rats; differential effects
of monoamine oxidase A and B inhibitors. J Neurochem
1994; 63: 108-17.
8. Fornai F, Giorgi FS, Bassi L et al. Modulation of dihy-
droxyphenylacetaldehyde extracellular levels in vivo in
the rat striatum after different kinds of pharmacological
treatment. Brain Res 2000; 861: 126-34.
9. Stokes AH, Lewis DY, Lash LH et al. Dopamine toxicity
in neuroblastoma cells: role of glutathione depletion by
L-BSO and apoptosis. Brain Res 2000; 858: 1-8.
10. Hellström E, Tottmar O. Effects of aldehyde dehydroge-
nase inhibitors on enzymes involved in the metabolism
of biogenic aldehydes in rat liver and brain. Biochem Phar-
macol 1982; 31: 3899-905.
11. Nomura F, Itoga S, Tamura M et al. Biological markers of
alcoholism with respect to genotypes of low-Km alde-
hyde dehydrogenase (ALDH2) in japanese subjects. Alco-
hol Clin Exp Res 2000; 24: 30S-33S.
12. Legros H Janin F Dourmap N et al. Semi-chronic increase
in striatal level of 3,4-dihydroxyphenylacetaldehyde does
not result in alteration of nigrostriatal dopaminergic neu-
rones, J Neurosci Res 2004; 75: 429-35.
Références
13. Murer MG, Dziewczapolski G, Menalled LB et al. Chronic
levodopa is not toxic for remaining dopamine neurones,
but instead promotes their recovery, in rats with mode-
rate nigrostriatal lesions. Ann Neurol 1998; 43: 561-75.
1. Mattammal MB, Haring JH, Chung HD et al. An endoge-
nous dopaminergic neurotoxin: implication for Parkin-
son’s disease. Neurodegeneration 1995; 4: 271-81.
330

Toxicité du DOPAL in vitro et in vivo
14. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth
and survival: application to proliferation and cytotoxicity
assays. J Immunol Meth 1983; 65: 55-63.
26. Jones DC, Gunasekar PG, Borowitz JL, Isom GE. Dopa-
mine-induced apoptosis is mediated by oxidative stress
and is enhanced by cyanide in differentiated PC 12 cells.
J Neurochem 2000; 74: 2296-304.
15. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein
measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem
1951; 193: 265-75.
27. Keller JN, Huang FF, Dimayuga ER, MaragosW. Dopa-
mine induces proteasome inhibition in neural PC12 cell
line. Free Rad Biol Med 2000; 10: 1037-42.
16. Cleren C, Vilpoux C, Dourmap N et al. Acute interactions
between L-DOPA and the neurotoxic effects of 1-methyl-
4-phenylpyridinium or 6-hydroxydopamine in mice.
Brain Res 1999; 830: 314-9.
28. Brewer C. Recent developments in disulfiram treatment.
Alcohol Alcohol 1993; 28: 383-95.
29. Yoshida A. Molecular genetics of human aldehyde dehy-
drogenase. Pharmacogenetics 1992; 2: 139-47.
17. Glowinski J, Iversen LL. Regional studies of catecholami-
nes in the rat brain-I. The disposition of 3H-norepi-
nephrine, 3H-dopamine and 3H-DOPA in various regions
of the brain. J Neurochem 1966; 13: 655-69.
30. Stewart MJ, Malek K, Crabb DW. Distribution of messen-
ger RNAs for aldehyde dehydrogenase 1, aldehyde dehy-
drogenase 2, aldehyde dehydrogenase 5 in human
tissues. J Investig Med 1996. 44: 42-6.
18. Colzi A, Musolino A, Iuliano A et al. Identification and
determination of 3,4-dihydroxyphenylacetaldehyde, the
dopamine metabolite in in vivo dialysate from rat stria-
tum. J Neurochem 1996; 66: 1510-7.
31. Vasiliou V, Pappa A, Petersen DR. Role of aldehyde dehy-
drogenase in endogenous and xenobiotic metabolism.
Chem Biol Interact 2000; 129: 1-19.
32. Minegishi A, Satoh T, Fukumori R et al. Susceptibility of
brain aldehyde metabolizing enzymes to pargyline, disul-
firam and diethylmaleate in vivo in rats. Life Sci 1979; 24:
1131-6.
19. Baraldi PG, Simoni D, Manfredini S, Menziani E. Prepa-
ration of 3,4-dihydroxy-1-benzeneethanol: a reinvestiga-
tion. Liebigs Ann Chem 1983; 684- 6.
20. Lai CT, Yu PH. Dopamine- and L-ß-3, 4-dihydroxyphe-
nylalanine hydrochloride (L-Dopa)- induced cytotoxicity
towards catecholaminergic neuroblastoma SH-SY5Y
cells. Biochem Pharmacol 1997; 53: 363-72.
33. Manna C, Galletti P, Maisto G et al. Transport mechanism
and metabolism of olive oil hydroxytyrosol in Caco-2
cells. FEBS Letters 2000; 470: 341-4.
34. Anglade P, Vyas S, Javoy-Agid F et al. Apoptosis and
autophagy in nigral neurones of patients with Parkin-
son’s disease. Histol Histopathol 1997; 12: 25-31.
35. Adams JD Jr, Chang M-L, Klaidman L. Parkinson’s
disease-redox mechanisms. Curr Med Chem 2001; 8: 809-
14.
21. Masserano JM, Gong L, Kulaga H et al. Dopamine induces
apoptotic cell death of a catecholaminergic cell line deri-
ved from the central nervous system. Molec Pharmacol
1996; 50: 1309-15.
22. Offen D, Gorodin S, Melamed E et al. Dopamine-melanin
is actively phagocyted by PC12 cells and cerebellar gra-
nular cells: possible implications for the etiology of Par-
kinson’s disease. Neurosci Lett 1999; 260: 101-4.
23. Mc Laughlin BA, Nelson D, Erecinska M, Chesselet MF.
Toxicity of dopamine to striatal neurons in vitro and
potentiation of cell death by a mitochondrial inhibitor. J
Neurochem 1998; 70: 2406-15.
36. Hornykiewicz O, Kish S. Biochemical pathophysiology of
Parkinson’s disease. In: Yahr M D, Bergmann KJ, editors.
Advances in Neurology, Vol. 45. New York: Raven Press;
1986, 19-34.
37. Agid Y. Levodopa: is toxicity a myth? Neurology 1998; 50:
858-63.
38. Datla KP, Blunt SB, Dexter DT. Chronic L-DOPA admi-
nistration is not toxic to the remaining dopaminergic
nigrostriatal neurons, but instead may promote their
functional recovery, in rats with partial 6-OHDA or FeCl3
nigrostriatal lesions. Mov Disord 2001; 16: 424-34.
39. Mena M, Casarejos M, Carazo A et al. Glia protect fetal
midbrain dopamine neurons in culture from L-DOPA
toxicity through multiple mechanisms. J Neural Transm
1997; 104: 317-28.
24. Cantuti-Castelvetri I, Joseph JA. Differential effect of
dopamine catabolism and uptake inhibition on dopa-
mine-induced calcium dysregulation and viability loss.
Free Rad Biol Med 1999; 27: 1393-404.
25. Simantov R, Blinder E, Ratovitski T et al. Dopamine-indu-
ced apoptosis in human neuronal cells: inhibition by
nucleic acids antisense to the dopamine transporter. Neu-
rosci 1996; 74: 39-50.
331